一種塔里木馬鹿茸c-myc基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種馬鹿茸基因及其應(yīng)用，具體涉及一種塔里木馬鹿茸c-myc基因及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鹿又名赤鹿，是體型較大的鹿種之一，據(jù)統(tǒng)計全世界有22個馬鹿亞種，在我國 有天山亞種、塔里木亞種、阿勒泰亞種、東北亞種、甘肅亞種、阿拉善亞種、四川亞種和西藏 亞種8個馬鹿亞種，主要分布在新疆、青海、甘肅、東北和內(nèi)蒙古等地區(qū)。塔里木馬鹿是中國 馬鹿種群的一個優(yōu)秀亞種，對塔里木盆地的荒漠區(qū)具有獨特的適應(yīng)性，可耐酷熱、耐干旱、 耐風(fēng)沙、耐高鹽堿，因世代在塔里木盆地繁衍生息而得名。塔里木馬鹿是名貴的特種經(jīng)濟動 物，以高產(chǎn)茸量且質(zhì)優(yōu)而著稱，并被國際市場譽為"亞洲之花"。公鹿鹿茸每天增重可達到 100g~180g，生長75d~95d就可鋸茸，重量一般可在IOkg以上。塔里木馬鹿每年都進行 周期性替代，一般要經(jīng)過脫盤、生茸、骨化、脫落，再生茸循環(huán)過程，每個生長周期可以采兩 次鹿茸，第一次在生長開始的第二個月末即每年的4月至6月末，短暫的恢復(fù)之后，鋸后的 茸角會再次萌發(fā)，可以再生長一個半月到8月中旬再鋸第二次。塔里木馬鹿養(yǎng)殖業(yè)是當(dāng)?shù)?畜牧經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)之一，在新疆南部地區(qū)為農(nóng)民增產(chǎn)增收，生活致富起到了及其重要的 作用，同時作為一個品質(zhì)比較優(yōu)秀的鹿茸，塔里木馬鹿茸值得進行大力開發(fā)。
[0003] 目前，對于馬鹿茸生長的分子機制研宄報道極少，有關(guān)馬鹿茸生長相關(guān)基因沒有 研宄報道。人工養(yǎng)殖的鹿主要通過割后再生，提高產(chǎn)茸量，但是收割后的馬鹿不用藥物處 理，雖然馬鹿茸能夠再生，但產(chǎn)量非常低，即使注射藥物，也無法達到頭茬茸的生產(chǎn)能力。因 此，再生茸比頭茬茸生長速度慢，骨化程度大，產(chǎn)量低。迫切需要研宄提高再生茸產(chǎn)量的機 制，為塔里木馬鹿茸大力開發(fā)提供線索。通過馬鹿茸生長相關(guān)基因的開發(fā)和研宄，對高產(chǎn)茸 鹿群的選育以提高新疆馬鹿茸產(chǎn)量是目前研宄的重要內(nèi)容，同時對本地經(jīng)濟動物生產(chǎn)性能 提高的重要舉措。因此，C-myc基因的序列的發(fā)現(xiàn)及其對產(chǎn)茸有顯著相關(guān)的單核苷酸突變 的發(fā)現(xiàn)均有重大意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種人工合成得到促茸塔里木馬鹿茸c-myc 基因及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，
[0006] 本發(fā)明之一種塔里木馬鹿茸c-myc基因，其基因的核苷酸序列如SED ID NO :1所 不O
[0007] 本發(fā)明之一種塔里木馬鹿茸c-myc基因的克隆方法，包括以下步驟：
[0008] (1)馬鹿茸總RNA提取、純化；
[0009] (2) cDNA第一鏈的合成、純化：采用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSPl如SED ID NO :2所示，對馬鹿茸總RNA進行目的基因第一鏈cDNA的合成、純化；
[0010] (3)馬鹿鸞c-myc基因保守序列的克?。河门-myc基因全長序列 (NM001046074.2)設(shè)計引物 F:5'CATTCGCGAAACTTTGCCCA3'，如 SED ID N0:3 和 R: 5'CAGGTACAAGCTGGAGGTGG3'，如 SED ID NO :4 所示，以馬鹿茸的 mRNA 合成的第一鏈 cDNA 為 模板進行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 0 %的瓊脂糖凝膠電泳分離，用瓊脂凝膠回收試劑盒回 收、純化，然后將擴增產(chǎn)物測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計全長克隆引物；
[0011] (4)5'端序列RACE克?。翰捎肨dT酶和dCTP對純化后的第一鏈CDNA進行末 端加上多聚C;接著采用引物GSP2如SED ID N0:5所示和橋連鉚釘引物AAP:GGCCACGC GTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG，如 SED ID NO :6 所示對已經(jīng)加 dC 尾的第一鏈 cDNA 進 行PCR第一輪擴增；然后采用引物GSP3如SED ID NO :7所示和橋連通用擴增引物AUAP: GGCCACGCGTCGACTAGTAC如SED ID NO :8所示，進行巢式PCR第二輪擴增，將第二輪PCR產(chǎn) 物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化；
[0012] ⑶ 3' 端序列 RACE 克隆：米用逆轉(zhuǎn)錄酶 SMARTScribe? Reverse Transcriptase 和引物3'CDS primer A，對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;接著采用引物3'端497-1如SED ID NO :9所示和UPM :AAAAAAAAAGA，如SED ID NO :10所示，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進 行第一輪PCR擴增；然后將第一輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋50倍，用引物3'端497-2如SED ID NO : 11所示和UPM，進行巢式第二輪PCR擴增；PCR產(chǎn)物進行電泳并對目的條帶進行切膠回 收純化，PCR產(chǎn)物克隆測序。
[0013] (6)馬鹿茸c-myc基因 cDNA全長克?。豪肈NASTAR將所得到的純化的保守序列、 5'端序列、3'端序列進行序列拼接，得到馬鹿茸c-myc基因 cDNA全長序列。
[0014] 進一步，對cDNA第一鏈擴增，5'端序列RACE克隆的PCR第一輪、第二輪擴增，3' 端序列RACE克隆的PCR第一輪、第二輪擴增中PCR反應(yīng)條件均為94°C預(yù)變性lmin，94°C變 性 0· 5min，55°C 退火 0· 5min，72°C 延伸 2min，35 個循環(huán)，72°C 終延伸 7min。
[0015] 本發(fā)明之一種塔里木馬鹿茸c-myc基因在促茸生長中的應(yīng)用，所述c-myc基因含 有兩個單核苷酸多態(tài)點。
[0016] 進一步，所述單核苷酸多態(tài)點的基因型為CG。
[0017] 本發(fā)明之塔里木馬鹿茸c-myc基因改變了鹿茸依賴自然或藥物處理的再生茸生 長緩慢現(xiàn)狀，實現(xiàn)了鹿茸產(chǎn)品的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)。實驗證明，本發(fā)明的SNP基因分型CG可 使馬鹿茸重13. 441 ± 1.88kg。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步加以說明。
[0019] 實施例1 :馬鹿茸c-myc基因 cDNA全長克隆
[0020] 1、馬鹿茸總RNA提取、純化：取3-4歲成年馬鹿茸皮組織儲存于液氮中。
[0021] (1)取0. 5-lg組織在液氮中充分碾碎后，加3ml Trizol試劑劇烈震蕩以對組織進 行裂解；
[0022] (2)將上述組織Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中，在室溫下放置5分鐘；
[0023] (3)在上述EP管中，按照每1ml Trizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管 蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下放置3分鐘后，12000g(2-8°C )離心15分鐘；
[0024] (4)去上層水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加0· 5ml異丙醇的量加入異丙 醇，在室溫下放置10分鐘后，12000g(2-8°c )離心10分鐘；
[0025] (5)棄上清，按照每1ml Trizol加 Iml 75 %乙醇進行洗絳，禍旋混合， 7500g(2-8°C )離心5分鐘，棄上清；
[0026] (6)讓沉淀的RNA在室溫在自然干燥；
[0027] (7)用Rnase-free water溶解RNA沉淀，用瓊脂糖電泳和紫外分光光度計檢測其 濃度。
[0028] 2、cDNA第一鏈的合成、純化：
[0029] (1)采用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSPl對總RNA進行目的基因第一鏈cDNA 的合成、純化，使用RNase Mix對合成的cDNA進行去RNA處理。
[0030] a加入下列試劑到0. 5-ml PCR管中
[0031]
【主權(quán)項】
1. 一種塔里木馬鹿鸞c-myc基因，其特征在于，所述c-myc基因的核苷酸序列如SED ID NO : 1所示。
2. -種如權(quán)利要求1所述的塔里木馬鹿茸c-myc基因的克隆方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 馬鹿茸總RNA提取、純化； (2) cDNA第一鏈的合成、純化：采用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSPl如SED ID NO : 2所示，對馬鹿茸總RNA進行目的基因第一鏈cDNA的合成、純化； (3) 馬鹿茸c-myc基因保守序列的克隆：用牛c-myc基因全長序列（NM001046074. 2)設(shè) 計引物如SED ID NO :3和SED ID NO :4所示，以馬鹿茸的mRNA合成的第一鏈cDNA為模板 進行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用瓊脂凝膠回收試劑盒回收、 純化，然后將擴增產(chǎn)物測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計全長克隆引物； (4) 5'端序列RACE克?。翰捎肨dT酶和dCTP對純化后的第一鏈cDNA進行末端加上多 聚C ;接著采用引物GSP2如SED ID NO :5所示和橋連鉚釘引物AAP如SED ID NO :6所示對 已經(jīng)加dC尾的第一鏈cDNA進行PCR第一輪擴增；然后采用引物GSP3如SED ID NO :7所示 和橋連通用擴增引物AUAP如SED ID NO :8所示，進行巢式PCR第二輪擴增，將第二輪PCR 產(chǎn)物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化； (5) 3' 端序列 RACE 克?。好子媚孓D(zhuǎn)錄酶 SMARTScribe? Reverse Transcriptase 和引 物3' CDS primer A，對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;接著采用引物3'端497-1如SED ID NO :9所示和UPM如SED ID NO :10所示，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行第一輪PCR擴增； 然后將第一輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋50倍，用引物3'端497-2如SED ID NO : 11所示和UPM， 進行巢式第二輪PCR擴增；PCR產(chǎn)物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化，PCR產(chǎn)物克 隆測序。 (6) 馬鹿茸c-myc基因cDNA全長克?。豪肈NASTAR將所得到的純化的保守序列、5' 端序列、3'端序列進行序列拼接，得到馬鹿茸c-myc基因cDNA全長序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的塔里木馬鹿茸c-myc基因的克隆方法，其特征在于，對cDNA 第一鏈擴增，5'端序列RACE克隆的PCR第一輪、第二輪擴增，3'端序列RACE克隆的PCR第一 輪、第二輪擴增中PCR反應(yīng)條件均為94°C預(yù)變性lmin，94°C變性0. 5min，55°C退火0. 5min， 72°C延伸2min，35個循環(huán)，72°C終延伸7min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的塔里木馬鹿茸c-myc基因在促茸生長中的應(yīng)用，其特征在于， 所述c-myc基因含有兩個單核苷酸多態(tài)點。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的塔里木馬鹿茸c-myc基因在促茸生長中的應(yīng)用，其特征在于， 所述單核苷酸多態(tài)點的基因型為CG。
【專利摘要】一種塔里木馬鹿茸c-myc基因及其應(yīng)用，所述c-myc基因的核苷酸序列如SED ID NO：1所示。本發(fā)明塔里木馬鹿茸c-myc基因還包括在促茸生長中的應(yīng)用。本發(fā)明之塔里木馬鹿茸c-myc基因改變了鹿茸依賴自然或藥物處理的再生茸生長緩慢現(xiàn)狀，實現(xiàn)了鹿茸產(chǎn)品的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)。實驗證明，本發(fā)明的SNP基因分型CG可使馬鹿茸重13.441±1.88kg。
【IPC分類】C12N15-12, C12Q1-68, C12N15-10
【公開號】CN104805089
【申請?zhí)枴緾N201510261546
【發(fā)明人】韓春梅, 高慶華, 王姍姍, 孟浩, 鄭永富, 馬夢婷, 闞凡凡, 張勤
【申請人】塔里木大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月21日