一株可同時降解多種鄰苯二甲酸酯的壤霉菌(Agromyces sp.)MT-E的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及環境污染物生物處理技術領域，具體地，涉及一株新型鄰苯二甲酸 醋降解菌，更具體地，涉及一株可同時降解多種鄰苯二甲酸醋的壤霉菌sp.) MT-E0
【背景技術】
[0002] 鄰苯二甲酸酯，又稱酞酸酯，縮寫PAEs，是鄰苯二甲酸形成的酯的統稱。其中，鄰 苯二甲酸二丁醋（di_/?-butyIphthalate，DBP)和鄰苯二甲酸二異辛醋（di_ (2-ethyIhexyl) phthalate，DEHP)是兩種最廣泛使用的塑料增塑劑，在PVC塑料中其含量可達40~60%。近 幾十年來，我國塑料大棚和農膜使用量急劇增加。隨著塑料薄膜的大量使用，越來越多的 DBP和DEHP被釋放進入農田土壤，它們已成為在農田土壤中最常被檢出的有機污染物，檢 測級別達到mg/kg。研宄表明，這兩種鄰苯二甲酸酯具有高毒性，致畸性、致癌性和致突變 性，以及生殖毒性，已被美國環境保護局（EPA)列為優先控制污染物。因此，我國農業土壤 中的DBP和DEHP污染問題亟待解決。
[0003] 由于這兩種鄰苯二甲酸酯的化學穩定性很好，自然條件下通過光解、水解等化學 作用消失的速率非常緩慢，其半衰期長達20年之久，絕大部分的DBP和DEHP主要是通過 生物降解途徑從環境中消失。其中微生物降解具有成本低，條件溫和，不產生二次污染等優 點，符合構建環境友好型及資源節約型社會的要求與發展趨勢。因此，利用微生物的降解作 用將DBP和DEHP轉化為無害物質是去除環境中鄰苯二甲酸酯污染的最佳手段。
[0004] 目前，國內外學者已分別針對DBP和DEHP篩選出許多具有良好降解性能的菌株， 但其中能夠同時降解這兩種鄰苯二甲酸醋的菌株很少。壤霉菌)是土壤中 廣泛存在的一類菌屬，目前有報道該菌屬的某些菌種具有可高效降解苯酚、農藥噻蟲嗪及 耐重金屬的特性，但尚未見其可降解鄰苯二甲酸酯的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明為了克服現有技術的上述不足，提供一株新型鄰苯二甲酸酯降解菌。
[0006] 為了實現上述目的，本發明是通過以下方案予以實現的： 一株壤霉菌)菌株MT-E，所述菌株于2015年1月22日保藏在中國典型 培養物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO: M 2015054,保藏地址為：中國武漢武漢大 學，菌株分類命名為MT-E。
[0007] 本發明所述壤霉菌)菌株MT-E是從常年使用塑料大棚的農田土壤 中分離篩選獲得的，該菌株可同時高效降解DBP和DEHP，因此本發明補充了鄰苯二甲酸酯 降解菌的種質資源，也為進一步研發PAEs污染的農田土壤的生物修復技術提供了科學依 據，具有廣泛的應用潛力。
[0008] 壤霉菌)菌株MT-E在牛肉膏蛋白胨培養基（LB)上劃線培養7天， 菌落呈暗黃色、扁平、濕潤、邊緣不平整、擴散生長，七天后幾乎鋪滿平板。掃面電子顯微鏡 下呈短桿狀，長約〇. 8~1. 5微米，寬約0. 3~0. 5微米。經生理生化檢測，該菌為革蘭氏陽性 菌。另外，該菌株的最適生長條件為：溫度30~35°C，pH為6.0~8.0。
[0009] 壤霉菌)菌株MT-E的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO: 1所示，通 過NCBI官方網站（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)的BLAST程序與其他已登錄細菌菌株 16S rDNA序列進行比對，結果表明該菌株與相似性最高，同源率達99%。
[0010] 壤霉菌（命)菌株MT-E具有同時高效降解DBP和DEHP的能力。將制備 好的MT-E菌種懸液接種于均含有200 mg/L的DBP和DEHP的MSM培養基三角瓶中，該菌以 DBP和DEHP作為唯一碳源生長，并對其具有高效的降解率。在第1，3, 5, 7天對DBP的降解 率分別為 8. 40%，40. 64%，89. 30%，97. 06% ;對 DEHP 的降解率分別為 5. 31%，30. 92%，73. 12%， 86. 25%。可見，該菌株對兩種鄰苯二甲酸酯均具有良好的降解效果。
[0011] 將該菌株接種于DBP和DEHP污染的土壤中，30°C避光靜置培養10天后，與未接菌 的對照相比，該菌株顯著降低了土壤中DBP和DEHP的含量。在第10天對DBP和DEHP的降 解率分別為77. 29%和55. 51%。而對照組DBP和DEHP的自然降解率分別為9. 37%和7. 87%。 說明該菌株在DBP和DEHP污染的土壤修復中具有極大的應用潛力。
[0012] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果： 本發明提供了一株可同時高效降解DBP和DEHP的新菌株一壤霉菌) MT-E，豐富了鄰苯二甲酸酯降解菌的種質資源庫，而且該菌株在土壤中分布廣泛，易于培 養，適應能力強；另外通過土壤修復實驗說明了該菌實際污染土壤的生物處理中將有巨大 的應用前景。
【附圖說明】
[0013] 圖1為MT-E菌株在LB培養基上培養7天的生長形態特征。
[0014] 圖2為MT-E菌株的掃描電鏡照片。
[0015] 圖3為MT-E菌株的16S rDNA的系統發育樹。
[0016] 圖4為MT-E菌株對DBP和DEHP的降解動力學及生長曲線。
[0017] 圖5為MT-E菌株對污染土壤中DBP和DEHP的降解效果。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合說明書附圖和具體實施例來進一步詳細闡述本發明。本發明以下實施例 為本發明較佳的實施方式，本發明主要闡述所述菌株以及基于所述菌株的應用思想，實施 方式中簡單參數的替換不能一一在實施例中贅述，但并不因此限制本發明的保護范圍，其 他任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，應被視為等 效的置換方式，包含在本發明的保護范圍之內。
[0019] 實施例中所述培養基配方如下： 無機鹽培養液（MSM，g/L) :Κ2ΗΡ04:5· 8, ΚΗ2Ρ04:4· 5,（NH4)2S04:2. 0，MgCl 2:0· 16, CaCl 2: 0· 02, Na2MoO4 · 2H20 :0· 0024, FeCl3:0. 0018, MnCl 2 · 2H20 :0· 0015。最終 pH 為 7· 5。
[0020] 牛肉膏蛋白胨培養基（LB):酵母粉5. 0 g，蛋白胨10. 0 g，氯化鈉10. 0 g，加超純 水至1L，調節pH= 7. 0 ;121°C滅菌20min。固體平板則添加 I. 5% (w/v)瓊脂粉。
[0021] 實施例1菌株的分離與鑒定 采集常年使用塑料大棚的農田土壤，稱取5 g新鮮土壤樣品于含有50 mL無菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，150 rpm培養3天后取5 mL污泥懸液加入含有100 mL DBP和DEHP (分別為50 mg/L)的MSM培養基中。經30°C，150 rpm培養7天后，每次按I mL的接種量 連續富集、轉接10次，并相應提高培養基中PAEs含量至1000 mg/L。然后將馴化10次的 培養液稀釋1〇3~1〇5涂布于LB固體平板上，30°C倒置培養1~3天。待平板上長出單菌落后， 挑取單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細菌，編號MT-E。然后將菌株接種于LB固體平板 上30°C倒置培養7天，觀察其菌落形態(見圖1)。由圖1可知，菌落呈暗黃色、扁平、濕潤、 邊緣不平整、擴散生長，七天后幾乎鋪滿平板。
[0022] 掃描電鏡觀察鑒定：將純化后的菌株MT-E接入含有10 mL的LB液體培養基過夜 活化。吸取800 μ L菌液經8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS溶液洗 菌3次。在收獲的菌體沉淀中加入I mL的2. 5%戊二醛充分混勻，4°C靜置過夜。然后再次 經8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS溶液洗菌3次。隨后將菌體分別在 30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脫水2次，每個梯度約浸泡15 min，然后8000 rpm離心去上清液，最后用乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次20 min，方法同上述乙醇脫水過 程。經過〇)2干燥后制片觀察。圖2可見在掃描電鏡下MT-E菌體呈短桿狀，長約0.8~1. 5 微米，寬約〇. 3~ 0. 5微米。
[0023] 將MT-E菌株進行生理生化特征鑒定，鑒定結果見表1。
[0024] 表1. MT-E菌株的生理生化特征鑒定
【主權項】
1. 一株壤霉菌（)菌株MT-E，所述菌株于2015年1月22日保藏在中國 典型培養物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :M 2015054。
2. 根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株MT-E能同時降解鄰苯二甲酸二 丁酯和鄰苯二甲酸二異辛酯。
3. 根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株為革蘭氏陰性菌，在LB培養基上 菌落呈暗黃色、扁平、濕潤、邊緣不平整、擴散生長，七天后幾乎鋪滿平板。
4. 根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
【專利摘要】本發明屬于環境污染物生物處理技術領域，具體公開了一株可同時降解多種鄰苯二甲酸酯的壤霉菌(Agromyces sp.)MT-E。所述菌株于2015年1月22日保藏在中國典型培養物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC NO：M2015054。該菌能夠以DBP和DEHP為唯一碳源進行好氧降解，在分別含有200mg/L的DBP和DEHP為唯一碳源的無機鹽培養基中7天的降解率分別可達97.06%和86.25%。將該菌接種于污染土壤10天后，土壤中DBP和DEHP的降解率分別可達77.29%和55.51%，其高效的降解速率說明該菌在PAEs污染的土壤修復中具有良好的應用前景。CCTCC NO：M201505420150122
【IPC分類】B09C1-10, C12R1-645, C12N1-14
【公開號】CN104805018
【申請號】CN201510066111
【發明人】莫測輝, 趙海明, 李彥文, 蔡全英, 李慧, 杜歡, 林靜, 馮乃憲
【申請人】暨南大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年2月9日