血紅蛋白的制備方法
【專利說明】
(-)技術領域:
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，特別是血紅蛋白的制備方法。
(二)【背景技術】:
[0002]以輸入全血為主要手段的傳統輸血方式在醫療救護方面發揮了極為重要的作用，但同時其自身也存在難以克服的各種缺點，主要表現在:輸入前需進行交叉配型、存在多種病毒交叉感染的危險、血源緊張、貯存期較短且需要特殊的設施。為了解決上述矛盾，人們早在19世紀末就開始了有關紅細胞代用品的研宄。紅細胞代用品是指具有擴充血容積、維持血管內外滲透壓平衡并且有載氧功能，用以代替人紅細胞的各種氧載體的總稱。血液代用品的研制經歷了從最初無載氧功能的血管擴容劑，如:高滲鹽溶液、羥乙基淀粉溶液、明膠等到目前具有攜氧功能的各種載體溶液。目前正在研制的以血紅蛋白為基礎各類產品與全血比較具有諸多優點，如:來源廣泛、安全潔凈、可長期保存、輸入人體前無需進行交叉配型，特別適用于戰爭、自然災害、以及其他突發事件中大量出血病人的急救。血紅蛋白是人體內的物質，它的溶液作為紅細胞代用品比化學合成物質更具優越性。
[0003]目前已有5家以血紅蛋白為基礎的產品完成或接近完成了III期臨床研宄，取得了明顯的進展。然而，這些產品應用于臨床時都程度不同地出現了諸如血管收縮、血壓升高，心臟、腎臟、肝臟等器官受損等毒副作用。一般來講，以血紅蛋白為基礎的產品的來源為血庫過期血，將紅細胞破膜后釋放出血紅蛋白，之后對血紅蛋白進行純化、修飾得到制品。在破膜之后要求純化血紅蛋白中磷脂殘留量很低，否則會在后續的動物、臨床試驗中引起不良反應，因此在破膜時要求將血紅蛋白盡量釋放，但膜又不能破碎，即紅細胞膜形成完整的血影細胞，而不是碎裂成碎片懸浮于血紅蛋白溶液中。
(三)
【發明內容】
:
[0004]本發明的目的在于提供一種血紅蛋白的制備方法，它針對上述情況，發明一種操作簡便、成本低廉、高效的血紅蛋白的制備工藝。
[0005]本發明的技術方案:血紅蛋白的制備，其特征在于它包括以下步驟:
[0006]1、取適量的人血加入3-6倍體積的生理鹽水(0.9% NaCl溶液)，在4°C，2800轉的條件下離心，15-30分鐘。得到含白細胞，血漿蛋白和血小板的上清液并將其擠出，保留下層壓積紅細胞，重復上述洗滌過程3-5次以，直至上層清液基本無色，以最大限度除去紅細胞以外的其他物質，得到潔凈壓積紅細胞。
[0007]2、取一定量的壓積紅細胞，加入等體積的滅菌高純去離子水進行5-15分鐘的預脹，最后加入2倍體積的水低滲10-20分鐘，10000轉速下離心30-60分鐘，離心后上清液為血紅蛋白溶液。
(四)【具體實施方式】:
[0008]以下將通過【具體實施方式】的形式再對本發明的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅局限于以下的【具體實施方式】，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
[0009]實施例1洗血
[0010]取適量的人血加入3-6倍體積的生理鹽水(0.9% NaCl溶液)，在4°C，2800轉的條件下離心，15-30分鐘。得到含白細胞，血漿蛋白和血小板的上清液并將其擠出，保留下層壓積紅細胞，重復上述洗滌過程3-5次以，直至上層清液基本無色，以最大限度除去紅細胞以外的其他物質，得到潔凈壓積紅細胞。
[0011]實施例2預脹
[0012]取一定量的壓積紅細胞，加入等體積的滅菌高純去離子水進行預脹，預脹時間定為2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30分鐘，分別于400倍顯微鏡下觀察不同預脹時間細胞形態，根據細胞的圓潤程度確定最佳預脹時間。
[0013]實施例3低滲破膜
[0014]向預脹好的紅細胞中加入2倍體積的水低滲破膜，時間定為3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36，39，42，45，48，50分鐘，分別于400倍顯微鏡下觀察不同破膜時間細胞形態，根據細胞的破裂程度、純化血紅蛋白的濃度、破膜液過濾的難易程度確定最佳破膜時間。之后再10000轉速下離心30-60分鐘，離心后上清液為血紅蛋白溶液。
【主權項】
1.血紅蛋白的制備方法，其特征在于它包括以下步驟:取適量的人血加入3-6倍體積的生理鹽水(0.9% NaCl溶液)，在4°C，2800轉的條件下離心，15-30分鐘；得到含白細胞，血漿蛋白和血小板的上清液并將其擠出，保留下層壓積紅細胞，重復上述洗滌過程3-5次以，直至上層清液基本無色，以最大限度除去紅細胞以外的其他物質，得到潔凈壓積紅細胞；取一定量的壓積紅細胞，加入等體積的滅菌高純去離子水進行預脹，最后加入2倍體積的水低滲10-20分鐘，10000轉速下離心30-60分鐘，離心后上清液為血紅蛋白溶液。
2.根據權利要求1所述的血紅蛋白的制備方法，預脹的時間為5-15分鐘。
3.根據權利要求1所述的血紅蛋白的制備方法，低滲破膜的時間為10-20分鐘。
【專利摘要】本發明涉及的是血紅蛋白的制備方法，其特征在于它包括以下步驟：取適量的人血加入3-6倍體積的生理鹽水(0.9％NaCl溶液)，在4℃，2800轉的條件下離心，15-30分鐘。得到含白細胞，血漿蛋白和血小板的上清液并將其擠出，保留下層壓積紅細胞，重復上述洗滌過程3-5次以，直至上層清液基本無色，以最大限度除去紅細胞以外的其他物質，得到潔凈壓積紅細胞。取一定量的壓積紅細胞，加入等體積的滅菌高純去離子水進行5-15分鐘的預脹，最后加入2倍體積的水低滲10-20分鐘，10000轉速下離心30-60分鐘，離心后上清液為血紅蛋白溶液。
【IPC分類】C07K14-805, C07K1-14
【公開號】CN104804080
【申請號】CN201510218537
【發明人】李鳳娟, 張釋元, 劉洋, 候依萍, 黃雪雪, 蔣坤
【申請人】天津工業大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月28日