一種鑒別牛羊豬源性成分的引物組及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于食品檢測技術領域，具體涉及一種鑒別牛羊豬源性成分的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 自古以來"民以食為天"，"食"一直以來是人們日常生活中必不可少的一部分。隨 著社會經濟的發展，肉類及其制品成為人們日常食物的重要來源和組成部分。但是，國內外 市場上肉食品安全性事件時有發生，"瘦肉精事件"、"三聚氰胺事件"、"假牛肉事件"和"馬 肉風波"等食品問題層出不窮，同時帶來諸多社會問題。當今，食品的豐富多樣化改變了外 觀和氣味，這也給肉類摻假者帶來了可乘之機。這些問題不但直接損害了消費者的經濟利 益，還可能引發一系列社會問題。因此，國家監管部門先后頒布多項法律法規來規范動物性 食品銷售的多個環節。在技術上，國家質檢總局制定了一系列的標準方法用于牛、羊、豬等 物種成分的檢測，這對打擊摻假犯罪起到了一定作用。
[0003] 早期肉類鑒別依賴于感官和形態學檢驗，這些檢驗方法準確性低、局限度大，對于 深加工的肉類摻假基本無法鑒別。隨后發展了肉類形態學分析和成分鑒定方法，在這個過 程中基本確立了以特征性的蛋白和核酸作為靶標物質進行檢驗的思路。如今形成了蛋白檢 驗和DNA分析兩個不同的檢測方向，經過20多年的發展，鑒別精度和靈敏度均有極大提高。 但是當肉類經過物理處理如切碎、混合、蒸煮和熏烤等過程后失去了原有形態和質地，蛋白 質鑒定技術不能滿足對這些樣品檢測的需要。因此，有必要提供一種簡便易行、準確度更高 的檢測方法來檢測肉類成分。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種鑒別牛羊豬源性成分的引物組，包含有如下的引物：
[0005] 牛羊豬通用下游引物Seql :
[0006] TGGCTGGCACGAGATTTA(SEQ ID NO:l),
[0007] 牛羊通用上游引物Seq2 :
[0008] GCTGGACTTAACTGCATC(SEQ ID NO:2),
[0009] 豬特異性上游引物Seq3 :
[0010] ACGCCAATCTACCACAAA(SEQ ID N0:3)〇
[0011] 為了提高檢測的特異性，對上述的牛羊通用上游引物Seq2進行了優化，優化后的 引物信息如下：
[0012] 牛羊通用上游引物 Seq2 優選 1 :GCTGGACTTAACTGCAGC(SEQ ID N0:4)、
[0013] 牛羊通用上游引物 Seq2 優選 2 :GCTGGACTTAACTGCCTC(SEQ ID N0:5)。
[0014] 上述的引物組，擴增的牛、羊、豬源性成分的擴增的片段大小分別為549bp、570bp 和 420bp。
[0015] 本發明還提供一種鑒別牛羊豬源性成分的試劑盒，使用上述的引物組；
[0016] 所述的試劑盒，還包含有如下的組分：
[0017] PCR Buffer A液：含有 lOOpM dNTP、2. OmM MgCl2、lXPCR buffer、50U/L Taq聚合 酶、0. 6yM牛羊豬通用下游引物Seql、0. 3yM牛羊通用上游引物Seq2、0. 3yM豬特異性上 游引物Seq3和雙蒸水；
[0018] Positive B液：含有陽性DNA模板（總濃度50ng/yL，等比混合牛、豬和綿羊基因 組 DNA。
[0019] Negative C 液：蒸餾水。
[0020] 本發明與現有技術相比，可以在一次PCR反應中檢測牛、羊、豬三個物種，且具有 很高的穩定性和靈敏性。相對更為復雜的多重PCR技術，三引物PCR在一定程度上減少了 誤差，更為重要的是一次PCR就可以鑒定豬牛羊三個物種，省時省力。本發明基于PCR技術 平臺，對實驗室設備要求不高，適于基層單位應用。
【附圖說明】
[0021] 圖1 :是本發明對牛羊豬樣品的檢測結果。以中國荷斯坦牛、湖羊、美利奴羊、太湖 豬、長白豬的DNA為模板，擴增測試所有待檢樣品擴增性良好，混合樣品提取的DNA也完全 達到一致效果。圖中泳道編號備注如下：1 :DNA Marker ;2:牛；3 :羊；4 :豬；5 :牛羊豬；6 : 牛羊；7 :陰性對照。
【具體實施方式】：
[0022] 本發明經過對豬、牛、羊及常見物種的mtDNA全序列做精細對比，以包含物種特異 性序列兩端的保守區為引物設計區域，擴增區域序列由于存在插入-缺失片段而產物大小 不同，可在一步PCR中同時鑒定不同的物種，提高檢測效率。
[0023] 應當說明的是，本方法以綿羊基因組為參照設計完成，對山羊宜使用，具有與綿羊 源性成分同等檢測效果，但對山羊基因組擴增產物長度為575bp。
[0024] 下面結合實例對本發明的方法做進一步說明。下列實施例中未注明具體條件的實 驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中 所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。
[0025] 實施例1引物的設計及檢測
[0026] 1、引物的設計
[0027] 根據GenBank所公布的基因序列，以牛（JQ437479)、綿羊（NC_001941)和豬 (DQ534707)的線粒體DNA(mtDNA)全序列為模板，通過比對分析三個物種及常見動物（雞、 鴨、兔、鼠、馬、狗）的mtDNA序列，根據其基因序列的特異性和保守性，設計特異性引物。同 時，為了避免牛羊豬近緣物種的非特異性擴增，引入特異性錯配堿基以提高PCR的特異性， 設計了兩條通用引物的優選引物，分別在：T端倒數第二和第三個堿基引入G-A和C-T錯 配。引物序列如表1所示。
[0028] 表1:引物序列信息
[0029]
【主權項】
1. 一種鑒別牛羊豬源性成分的引物組，其特征在于，所述的引物組包含有序列為SEQ IDNO: 1的牛羊豬通用下游引物、序列為SEQIDN0:2的牛羊通用上游引物和序列為SEQID N0:3的豬特異性上游引物。
2. 如權利要求1所述的引物組，其特征在于，所述的牛羊通用上游引物的序列為SEQ IDN0:4〇
3. 如權利要求1所述的引物組，其特征在于，所述的牛羊通用上游引物的序列為SEQ IDN0:5〇
4. 一種鑒別牛羊豬源性成分的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒使用權利要求1-3 任一項所述的引物組。
5. 如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含有如下的組分： PCRBufferA液：含有IOOpMdNTP、2.0mMMgCl2、lXPCRbuffer、50U/LTaq聚合酶、 〇. 6yM牛羊豬通用下游引物、0. 3yM牛羊通用上游引物、0. 3yM豬特異性上游引物和雙蒸 水； PositiveB液：含有陽性DNA模板、 NegativeC液：蒸餾水。
6. 如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性DNA模板的濃度為50ng/yL。
【專利摘要】本發明提供一種鑒別牛羊豬源性成分的引物組及試劑盒，包含有牛羊豬通用下游引物Seq1、牛羊通用上游引物Seq2和豬特異性上游引物Seq3。本發明與現有技術相比，可以在一次PCR反應中檢測牛、羊、豬三個物種，且具有很高的穩定性和靈敏性。相對更為復雜的多重PCR技術，三引物PCR的在一定程度上減少了誤差，更為重要的是一次PCR就可以鑒定牛羊豬三個物種，省時省力。本發明基于PCR技術平臺，對實驗室設備要求不高，適于基層單位應用。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104789692
【申請號】CN201510246313
【發明人】薛超波, 管峰, 李素芳, 王萍亞, 黃朱梁, 顧佳瑛, 林昕
【申請人】舟山市食品藥品檢驗檢測研究院, 中國計量學院
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年5月13日