一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒和使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫療檢測技術領域，具體涉及一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒和 使用方法。
【背景技術】
[0002] 胚胎質量評估方法的優劣直接關系到輔助生殖臨床妊娠結局的好壞。目前，在胚 胎質量評估方法中，應用最廣泛的是對配子胚胎各時期的形態特征進行評分的形態學評價 法。主要通過觀察胚胎的發育與碎片化等指標進行評價，缺乏客觀的評價指標。
[0003] 文獻"精子RNA的研宄進展"（《癌變?畸變?突變》，2011第23卷，第5期）公開 了精子RNA在精子的運動、獲能、受精和胚胎發育等過程中起著非常重要的作用。精子RNA 可以作為衡量精子質量、預測精子受精能力的一個重要指標，同時，能夠影響受精后胚胎的 發育，對早期胚胎發育起到重要作用。
[0004] 通過基因芯片等技術，國外文獻"Human reproduction update"（Human R印rodtion Update，2013 19(6) 602-24)報導了通過檢測精子中的RNA分子檢測弱 精子癥、畸形精子癥等精子形態與活動度的異常。目前已知的標記物如PRM1、TSSK6、 miRNA-Let-7d等的差異表達可用于區分精子運動異常。盡管精子的轉錄本中可以檢測到近 3000個RNA分子，然而，目前還沒有通過芯片篩選找到可靠的基因指標，是否有單個RNA分 子可以作為胚胎發育的指標仍然不清楚，還不能從精子RNA中找到表達具體的RNA分子并 證實其對胚胎發育的作用。
【發明內容】
[0005] 針對現有的輔助生殖技術對胚胎發育缺乏客觀評價指標的問題，本發明提供了一 種用于胚胎發育質量評估的試劑盒和使用方法。臨床通過精子的分子標記物長非編碼RNA 分子LA16c390E6. 5 (Ensembl數據庫，基因登錄號：ENSG00000261641)能準確的預測胚胎 發育的潛能，并對療效檢測與輔助生殖方式的選擇有指導意義。
[0006] 為了實現上述發明目的，本發明采用如下的技術方案： 一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒和使用方法，其特征在于：用于測定精子長非編 碼RNA分子LA16c390E6. 5的不同表達水平的生物標志物檢測試劑，通過LA16c390E6. 5的 表達水平評估胚胎發育質量；所述LA16c390E6. 5的基因序列為：SEQID N0:1。
[0007] 本發明通過在原因不明的胚胎發育停止的精子樣本中通過長非編碼RNA與mRNA 的芯片，篩選出在胚胎發育停止的精子樣本中差異表達的一個精子表達的長非編碼RNA - LA16c390E6. 5。在收集的胚胎質量低下的精子樣本中通過檢測LA16c390E6. 5表達量，證實 其可以有效的預測第三代試管嬰兒產生的胚胎的優質胚胎的百分比。
[0008] 本發明所述的試劑盒包括陽性對照品、反轉錄體系、熒光定量PCR反應體系、SYBR Green試劑和LA16c390E6. 5特異性引物探針。
[0009] 本發明所述的陽性對照品為正常精子樣本的陽性RNA提取的CDNA。
[0010] 優選地，所述LA16c390E6. 5的特異性引物探針， 上游引物為（SEQID N0:2) :CTCAACATCACAGCACAGGG ; 下游引物為（SEQID N0:3) :AGCTGCTTGGCCTCAmTC。
[0011] 上述引物為特異的針對LA16C390E6. 5的熒光探針，通過熒光定量PCR的原理，特 異的擴增出針對該長非編碼RNA的相對于管家基因（actin)的相對表達量。
[0012] 本發明所述的胚胎發育質量評估試劑盒的使用方法，步驟如下： A、 RNA提取：采用RNA抽提試劑提取精液樣本中的RNA ; B、 熒光定量PCR :對提取到的RNA進行反轉錄成cDNA，取cDNA為模板，采用SYBR Green 染料法進行實時熒光定量PCR分析，檢測受試樣本與對照品的Ct值； C、 結果分析：將檢測值采用2-AACt方法換算成相對表達量。
[0013] 本發明通過基因表達芯片和長非編碼芯片（ArrayStar長非編碼基因芯片系統)， 篩選出在正常胚胎與低質量胚胎的男性精子樣本中差異表達最顯著的長非編碼RNA分子 LA16c390E6. 5,并通過擴大樣本得到了驗證。有益效果在于： 1、目前的胚胎質量評估方法無法做到定量地對胚胎發育進行客觀評價，本發明試劑盒 從精子的非編碼RNA的表達量入手，檢測所需的樣本量少，速度快，時間短，對預測胚胎的 發育潛能的特異性高，檢測方法標準化，易于臨床推廣。
[0014] 2、本發明首次提出精子長非編碼RNA LA16c390E6. 5作為預測導致不明原因胚胎 停滯發育的男性不育患者的檢測指標，并通過臨床樣本予以進一步的證實，為臨床診斷和 治療原因不明的胚胎發育停止提供明確的依據。
[0015] 3、對于精子中長非編碼RNA LA16c390E6. 5指標檢測異常的男性病人，可以通過治 療與干預后，通過檢測該指標的變化指導是否適合做輔助生殖技術的周期。
【附圖說明】
[0016] 圖1為胚胎發育質量高和低的精子樣本分別經試劑盒檢測得到的長非編碼RNA分 子LA16c390E6. 5相對表達量的分布圖。
[0017] 其中，ctl為高胚胎質量組，p為低胚胎質量組。
[0018] 圖2為精子長非編碼RNA LA16c390E6. 5的表達變化與胚胎質量的生存曲線的分 析結果圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合【具體實施方式】對本發明的實質性內容作進一步詳細的描述。
[0020] 實施例1 一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒，用于測定精子長非編碼RNA分子LA16c390E6. 5 的不同表達水平的生物標志物檢測試劑，通過LA16c390E6. 5的表達水平評估胚胎發育質 量；所述LA16c390E6. 5的基因序列為：SEQID N0:1。
[0021] 實施例2 一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒，用于測定精子長非編碼RNA分子LA16c390E6. 5 的不同表達水平的生物標志物檢測試劑，通過LA16c390E6. 5的表達水平評估胚胎發育質 量；所述LA16c390E6. 5的基因序列為：SEQID N0:1。
[0022] 試劑盒包括陽性對照品、反轉錄體系、熒光定量PCR反應體系、SYBR Green試劑和 LA16c390E6. 5特異性引物探針。
[0023] 實施例3 一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒，用于測定精子長非編碼RNA分子LA16c390E6. 5 的不同表達水平的生物標志物檢測試劑，通過LA16c390E6. 5的表達水平評估胚胎發育質 量；所述LA16c390E6. 5的基因序列為：SEQID N0:1。
[0024] 試劑盒包括陽性對照品、反轉錄體系、熒光定量PCR反應體系、SYBR Green試劑和 LA16c390E6. 5特異性引物探針。
[0025] 所述的陽性對照品為正常精子樣本的RNA提取的cDNA。
[0026] 實施例4 一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒，用于測定精子長非編碼RNA分子LA16c390E6. 5 的不同表達水平的生物標志物檢測試劑，通過LA16c390E6. 5的表達水平評估胚胎發育質 量；所述LA16c390E6. 5的基因序列為：SEQID N0:1。
[0027] 試劑盒包括陽性對照品、反轉錄體系、熒光定量PCR反應體系、SYBR Green試劑和 LA16c390E6. 5特異性引物探針。
[0028] 所述的陽性對照品為正常精子樣本的RNA提取的cDNA。
[0029] 所述LA16c390E6. 5的特異性引物探針， 上游引物為：CTCAACATCACAGCACAGGG ; 下游引物為：AGCTGCTTGGCCTCAmTC。
[0030] 實施例5 本發明所述的胚胎發育質量評估試劑盒的使用方法，步驟如下： A、 RNA提取：采用RNA抽提試劑提取精液樣本中的RNA ; B、 熒光定量PCR :對提取到的RNA進行反轉錄成cDNA，取cDNA為模板，采用SYBR Green 染料法進行實時熒光定量PCR分析，檢測受試樣本與對照品的Ct值； C、 結果分析：將檢測值采用2-AACt方法換算成相對表達量。
[0031] 具體實驗操作如下： 1、RNA提取：把3ml精液樣本收集到15ml離心管中，加入5mlPBS，1000g，5min洗滌兩 次，棄上清，收集沉淀，加入 lml Trizol Reagent (life technologies，REF15596026)提取 RNA〇
[0032] 2、反轉錄：反轉錄體系采用的引物來自于PrimeScript RT Reagent kit(TAKARA， RR037A)〇
[0033]按表1順序配制反轉錄反應體系 表1
【主權項】
1. 一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒，其特征在于：用于測定精子長非編碼RNA分 子LA16c390E6. 5的不同表達水平的生物標志物檢測試劑，通過LA16c390E6. 5的表達水平 評估胚胎發育質量；所述LA16c390E6. 5的基因序列為：SEQIDNO: 1。
2. 根據權利要求1所述的一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒，其特征在于：所 述的試劑盒包括陽性對照品、反轉錄體系、熒光定量PCR反應體系、SYBRGreen試劑和 LA16c390E6. 5特異性引物探針。
3. 根據權利要求1所述的一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒，其特征在于：所述的 陽性對照品為正常精子樣本的陽性RNA提取的cDNA。
4. 根據權利要求1所述的一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒，其特征在于：所述 LA16c390E6. 5的特異性引物探針， 上游引物為：CTCAACATCACAGCACAGGG; 下游引物為：AGCTGCTTGGCCTCAmTC。
5. 根據權利要求1所述的胚胎發育質量評估試劑盒的使用方法，其特征在于：步驟如 下： A、RNA提取：采用RNA抽提試劑提取精液樣本中的RNA; B、 熒光定量PCR:對提取到的RNA進行反轉錄成cDNA，取cDNA為模板，采用SYBRGreen 染料法進行實時熒光定量PCR分析，檢測受試樣本與對照品的Ct值； C、 結果分析：將檢測值采用2-AACt方法換算成相對表達量。
【專利摘要】本發明提供了一種用于胚胎發育質量評估的試劑盒和使用方法。該試劑盒為用于測定精子長非編碼RNA分子LA16c390E6.5的不同表達水平的生物標志物檢測試劑，通過LA16c390E6.5的表達水平評估胚胎發育質量；所述LA16c390E6.5的基因序列為：SEQID NO:1。臨床通過精子的分子標記物長非編碼RNA分子LA16c390E6.5能準確的預測胚胎發育的潛能，并對療效檢測與輔助生殖方式的選擇有指導意義。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104789684
【申請號】CN201510220546
【發明人】許文明, 王可, 楊明, 陳艷, 廖惠娟, 孫華欽
【申請人】四川大學華西第二醫院
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年5月4日