一種烏蘇里貉性別鑒定用pcr引物及其鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬生物檢測鑒定技術領域，具體涉及一種烏蘇里貉性別鑒定用PCR引物及 其鑒定方法。 技術背景
[0002] 貉是珍貴的毛皮動物之一。而對于貉的性別鑒定，除外部觀察的方法外，目前尚無 有效的其他手段。因此，人們對貉個體的性別判斷都是通過臨床觀察才鑒別出來的。然而在 野外，若只看到野生貉的糞便或血液，來判斷其雌雄是很難的，依據傳統方法只能觀察到貉 個體后才能定論，否則無法鑒定。因此急需一種有效、快速的診斷方法來鑒別貉個體雌雄。
[0003] 動物性別鑒定在農業生產、醫學、法學及考古學中均有著重要的應用價值。通過提 取野生動物殘留物（如糞便、血液和毛發等）中的DNA鑒定該動物的性別，可了解其群體 的性別比率，有利于對野生動物的合理保護和利用。目前，用于動物性別鑒定的PCR擴增的 基因主要有雄性性別決定基因（57P10和牙釉質基因MMZ)。
[0004] 57P1基因擴增法：57P1基因為哺乳動物的性別決定基因。由于SRY基因只存在于 雄性動物的Y染色體上，雌性個體沒有該基因，因此進行性別鑒定時，容易出現假陰性的結 果，為性別鑒定的特異性或準確性帶來困難。
[0005] 燦EZ基因擴增法：由于燦EZ基因同時位于X和Y染色體上（燦EZ府P MEZIO,且該 基因在多數動物雌雄個體的擴增片段大小不同，所以可用此方法進行動物性別鑒定，比57P7 基因具有更商的靈敏性。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于利用聚合酶鏈式反應（PCR)技術快速鑒定出烏蘇里貉的個體性 另IJ，為野外鑒別雌雄貉個體提供簡便易行的方法。本發明提供了一種鑒定烏蘇里貉性別的 PCR引物對，所述引物對中的一條引物為核苷酸序列表中的序列1所示的核苷酸，所述引物 對中的另一條引物為核苷酸序列表中的序列2所示的核苷酸。
[0007] 本發明還提供了一種烏蘇里貉性別鑒定的方法，其特征在于，該方法為：以待測的 烏蘇里貉總DNA為模板，采用烏蘇里貉性別鑒定用特異PCR引物對進行PCR擴增，PCR產物 經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果擴增出2條目的片段，大小分別為410bp、653 bp時則判定 該待測烏蘇里貉為雄性，如果僅擴增出1條片段，大小為653bp則判定該待測烏蘇里貉為雌 性。
[0008]上述方法所述的 PCR 反應體系為：Ex Taq 酶 0? 25ii L(5 U/ii L)、10XPCR buffer 2. 5 ii L、dNTP 0? 5 ii L (2 mMol/L)、PCR 引物各 0? 25 ii L (25 mMol/L)、DNA 模板 1 ii L，然后 用ddH20補足至25 ii L ;上述方法所述的PCR反應程序為：95°C預變性3 min，94°C變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸30 s，30個循環，最后72°C延伸10 min。
[0009] 上述方法所述的PCR擴增產物中，擴增出的Y染色體上410bp的片段為核苷酸序 列表中的序列3所示的核苷酸；擴增出的X染色體上653bp的片段為核苷酸序列表中的序 列4所示的核苷酸。
[0010] 本發明采用聚合酶鏈式反應技術方法鑒別烏蘇里貉的性別，為在野外烏蘇里貉的 性別鑒定提供新的鑒別方法，既快速簡便，又大幅度降低成本。
【附圖說明】
[0011] 圖1為特異引物在部分雌雄烏蘇里貉個體PCR擴增產物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0012] 以下為本發明的一個具體實施例： 1根據GenBank數據庫中同時存在于犬性染色體X染色體的基因序列 你似2.刃和性染色體Y染色體的屬因序列7)使用Primer5. 0軟件 設計了 1對擴增烏蘇里貉Amelogenin基因的引物，所述引物對中的一條引物為核苷酸序列 表中的序列1所示的核苷酸，所述引物對中的另一條引物為核苷酸序列表中的序列2所示 的核苷酸； 2用酚/氯仿法提取118只烏蘇里貉血液基因組DNA，0D26(l/0D28(l比值在1. 6~1. 8之 間的DNA質量可滿足實驗要求，根據0026(|數值及稀釋倍數，換算出待測DNA的濃度，并作 相應的稀釋，以50ng/ y L分裝，作為模板DNA ; 3以基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為：Ex Taq酶0. 25iiL (5 U/ iiL)、10XPCR buffer 2.5iiL、dNTP 0.5iiL (2 mMol/L)、PCR 引物各 0.25 iiL (25 mMol/ L)、DNA模板1 ii L，然后用ddH20補足至25 ii L ;PCR反應程序為：95°C預變性3 min，94°C 變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸30 s，30個循環；最后72°C延伸10 min; 4 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，部分電泳圖見圖1。圖1中從左至右，M泳道為 DL2000 DNAMarker ;1-4泳道為同時具有X、Y染色體的雄性烏蘇里貉個體PCR擴增結果，片 段大小分別為653bp、410 bp ;5-8泳道為只有X染色體的雌性烏蘇里貉個體PCR擴增結果， 片段大小為653bp。用此方法進行性別鑒定結果與烏蘇里貉個體性別記錄結果一致，見表 1; 表1烏蘇里貉性別鑒定結果
【主權項】
1. 一種鑒定烏蘇里貉性別的PCR引物對，所述引物對中的一條引物為核苷酸序列表中 的序列1所示的核苷酸，所述引物對中的另一條引物為核苷酸序列表中的序列2所示的核 苷酸。
2. -種利用權利要求1所述的性別鑒定用PCR引物對鑒定烏蘇里貉性別的方法，其特 征在于，該方法為：以待測的烏蘇里貉總DNA為模板，采用烏蘇里貉性別鑒定用PCR引物對 進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果擴增出2條片段，大小分別為410bp、 653bp時則判定該待測烏蘇里貉為雄性，如果僅擴增出1條片段，大小為653bp則判定該待 測烏蘇里貉為雌性。
3. 按權利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反應體系由下列成分組成：ExTaq 酶 0.25iiL(5U/iiL)、10XPCRbuffer2.5iiL、dNTP0.5iiL(2mMol/L)、PCR引物各 0. 25iiL(25mMol/L)、DNA模板IiiL，然后用ddH20補足至25iiL;所述PCR反應程序為： 95°C預變性3min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環，最后72°C延 伸 10min。
4. 按權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR擴增產物中，所述的410bp片段 為核苷酸序列表中的序列3所示的核苷酸；所述的653bp片段為核苷酸序列表中的序列4 所示的核苷酸。
【專利摘要】本發明公開了一種鑒定烏蘇里貉性別的PCR引物，所述PCR引物的核苷酸序列如核苷酸序列表中的序列1和序列2所示。本發明還提供了一種利用烏蘇里貉性別鑒定用PCR引物鑒定烏蘇里貉性別的方法，該方法為：以待測烏蘇里貉的總DNA為模板，利用烏蘇里貉性別鑒定用PCR引物進行PCR擴增，然后結合PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳技術確定烏蘇里貉個體的性別。本發明應用于烏蘇里貉的性別鑒定，既快速簡便，又結果準確。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104789651
【申請號】CN201510026343
【發明人】李玉梅, 閆守慶, 姚紀元, 白春燕, 趙志輝
【申請人】吉林大學, 吉林農業大學
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年1月20日