一種高密度rgd肽修飾材料的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫學領域，應用含RGD肽的聚合物刷涂層對固體材料表面進行修 飾，將細胞固定在材料表面，具體為一種高密度RGD肽修飾材料的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 生物細胞固定化技術是指利用化學或物理的手段將細胞自然固定或定位于限定 的空間區域內，保持其固有的催化活性，并能反復使用。固定化生物細胞能持續增殖、休 眠及衰亡，其活性始終保持穩定。固定化的生物細胞除保持其原有的識別、結合和催化活 性外，還具有易于分離、可重復使用及穩定性提高等顯著的優點。如果能將與細胞具有親 和力的固體材料作為一種生物醫用材料，在組織器官受損時植入體內，能夠修復受損組織 的正常功能，大大減少機體對于植入物的不良反應，同時使術后痊愈的速度大大加快。
[0003] 起初，外科學是以切開、切除病變組織為治病的主要手段，而當人體組織、器官因 病傷損毀，無法用現有的醫療手段修復其功能時，則可以用植入一種組織或器官的方法，取 代病損組織器官的功能，保持機體的正常生命活動。人體組織器官的更換有兩種，一種是同 種異體組織器官的移植，如腎移植、心臟移植、肝臟移植、角膜移植等，而目前在世界各國， 供體器官的來源有限都是限制異體器官移植的一大瓶頸；而另一種方法是是人造器官和組 織移植，如人工心臟瓣膜的植入、人工血管的移植、人工關節的植入、人工骨的植入以及人 工晶體的植入等。而人造器官的置換由于科學技術的進步，人造器官的結構和功能也在不 斷改近提高，已成功地在臨床推廣應用，顯著地提高了臨床治療水平。
[0004] 人造器官從本質看，是用人工材料制造的一種醫療器件或儀器，它們具有一種部 分或全部替代人體自然器官的功能。而對于植入生物活體內的高分子材料，一般應具有兩 種基本性能，即醫用功能性和生物相容性。醫用功能性是指材料在與生物體組織相結合后 能達到診斷或醫療的效果；而生物相容性是指材料和活體組織之間相互容納的程度。無論 什么材料植入人體，對機體內生物環境來說，它都是人體組織之外的一種異物，對于機體組 織細胞均會產生不同程度的物理化學因素刺激，如引起結締組織增生、組織鈣化等變化。同 時機體的神經、體液系統內環境對植入的生物材料也會產生一系列侵蝕影響和排異反應， 這是機體固有的一種防御機制。若這種排斥反應對機體生理功能、對材料本身的物理及化 學性狀造成了較嚴重的影響，甚至引起人工器官的功能喪失，嚴重的威脅到人體健康，那么 這種材料將無法應用于臨床治療。固定化細胞是指細胞受到物理化學等因素被約束或限制 在一定的空間范圍內，但細胞仍保留催化活性并具有能被反復或連續使用的活力。目前， 這項技術已經廣泛應用于發酵、制藥、環境保護等領域。常用的細胞固定方法有吸附法、包 埋法、交聯法、共價結合法、絮凝法等。包埋法將細胞定位于凝膠網格內或聚合物半透膜微 膠囊中，形成的結構可以防止細胞滲漏，但允許底物進入、產物擴散出。其缺點是擴散阻力 大、不適合催化大分子底物與產物的反應；共價結合法依靠細胞表面上功能團和固相支持 物表面的反應基團之間形成化學共價鍵連接，該方法細胞與載體結合緊密、不易脫落，但是 反應劇烈、條件難控制、細胞活性損失大、制備較難；交聯法該方法主要是通過多功能試劑 與細胞表面的基團（如巰基、羥基、氨基等）發生化學反應形成共價鍵，實現細胞的固定化。 該方法的突出特點是細胞與載體結合緊密，但化學反應劇烈，使細胞活性大大降低，制備麻 煩；吸附法是細胞與載體間通過物理吸附或離子作用結合將細胞固定在載體上的方法。該 方法操作簡單，對細胞的影響小，但是吸附力小、細胞易脫落。在傳統的細胞固定化方法中， 通過吸附作用固定細胞時，一般結合能力弱，細胞易脫落；而通過共價鍵作用將細胞固定的 方法則對細胞傷害大，無法保持細胞活性。
[0005] 因此滿足體內植入材料的首要條件，就是其生物相容性要高。生物系統對生物相 容性的影響包括生物體種類、植入部位、受體的健康狀況、埋植留存時間、使用的生理環境 等。一般說來，材料與生物體相互作用的反應主要集中于固體生物材料與體液接觸形成的 固一液界面上。聚合物刷是指高分子鏈一端固定在某個界面上而形成的一種聚合物組裝結 構，本發明通過一系列化學反應，將含有RGD肽的聚合物刷接枝在固體材料表面，形成薄涂 層。RGD肽是一類含有精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸序列的短肽，存在于多種生物細胞外基質 中，能特異性地識別細胞表面整合素并與之結合，從而介導多種重要的生理過程。而整合素 存在于大多數細胞表面，是一種介導細胞與細胞間的相互作用及細胞與細胞外基質間相互 作用的跨膜受體。通過細胞表面整合素與RGD肽的識別以及相互作用，可以使細胞黏附在 含RGD肽聚合物刷涂層的固體材料表面，將其應用于各類植入人體內的生物醫學材料中， 不僅大大增強了材料的生物相容性，降低了免疫排斥反應，而且這種黏附作用，使得體內細 胞在植入材料表面的適應性更好，更易增殖，大大降低了機體的不良反應。而該方法也可作 為一種新型色譜填料的合成方法，在細胞水平上研宄外源性藥物分子與其所攜帶的功能蛋 白質的相互作用。細胞是生物體生命活動的基本反應器，其所攜帶的功能蛋白質與外源性 藥物分子，內源性細胞因子、趨化因子及生長因子的相互作用，是啟動和完成后期級聯式信 號傳導過程的先決條件，也在本質上決定了生物體體內的每一種生理學過程。更為重要的 是，這種復雜的特異性相互作用過程與疾病的病理病機具有密切的關系，也往往被作為依 據進行新藥的研發和疾病的治療。如果能將整個細胞反應器通過特異的抗原抗體生理反應 固定擔體表面，作為色譜介質，則不僅能繼承經典親和色譜方法的優點，而且能克服其不能 體現功能蛋白質信號傳導過程的不足，從而可通過色譜方法在細胞水平上獲得功能蛋白質 與藥物配體相互作用和由此所產生的細胞器內生理學過程的更準確、更豐富的信息。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提一種高密度細胞活性固定化的方法，其制備方法反應條件溫 和，步驟簡便易行，能最大程度地保存細胞完整性與活性，吸附力強，細胞不易脫落。
[0007] 為實現上述目的本發明采用以下技術方案：
[0008] 一種高密度RGD肽修飾材料的制備方法，包括以下步驟：
[0009] (1)引發劑的制備
[0010] 將氨基微球分散于甲苯中，超聲10分鐘，加入催化量的4-二甲氨基吡啶，冰浴下 緩慢滴加入三乙胺及2-溴異丁酰溴，冰浴下繼續攪拌2小時后，升溫至室溫下攪拌12小時 充分反應，用砂芯漏斗抽濾，依次用干燥二氯甲烷、丙酮、甲醇洗滌后，溫度60°C真空下干燥 12小時，制得引發劑；
[0011] 反應路線如下所示：
【主權項】
1. 一種高密度RGD肽修飾材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 引發劑的制備 將表面帶活性基團修飾的材料分散于甲苯中，超聲10分鐘，加入催化量的4-二甲氨基 吡啶，冰浴下緩慢滴加入三乙胺及2-溴異丁酰溴，冰浴下繼續攪拌2小時后，升溫至室溫下 攪拌12小時充分反應，用砂芯漏斗抽濾，依次甲苯、丙酮、甲醇洗滌后，溫度60°C真空下干 燥12小時，制得引發劑； (2) 聚合物刷的合成 將步驟（1)所得引發劑加入至含有聚乙二醇甲基丙烯酸酯、溴化亞銅、2-2聯吡啶和甲 醇甲醇溶劑的混合溶液中，在氮氣保護攪拌反應6小時后停止表面轉移自由基聚合反應， 用純水和甲醇依次洗絳； (3) 聚合物刷的活化 將步驟⑵反應所得聚合物刷加入含活化試劑和4-二甲氨基吡啶的干燥的二甲基甲 酰胺溶液中，通入氮氣在室溫下反應6小時，反應結束后用二甲基甲酰胺溶液洗滌，得活化 的聚合物刷； (4) RGD的接枝 將活化的聚合物刷放入含有RGD肽和4-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中，在室溫 條件在避光反應18小時，用二甲基甲酰胺和磷酸鹽緩沖液依次洗滌，抽濾，即得RGD肽修飾 的聚合物刷； (5) 細胞的移入 將步驟（4)所得RGD肽修飾的聚合物刷保存在磷酸鹽緩沖液中，將細胞移入至含RGD肽修飾的聚合物刷中，以磷酸鹽緩沖液為懸浮液，溫度4°C下在搖床上反應20分鐘，即得高 密度RGD肽修飾材料。
2. 如權利要求1所述的一種高密度RGD肽修飾材料的制備方法，其特征在于，所述表面 帶活性基團修飾的材料為氨基微球、羧基微球、聚苯乙烯微球、聚乙烯醇微球、聚甲基丙烯 酸甲酯微的任一種。
3. 如權利要求1所述的一種高密度RGD肽修飾材料的制備方法，其特征在于，所述步驟 (2) 的甲醇溶劑為甲醇和水的混合液，且甲醇和水體積比為4 :1。
4. 如權利要求1所述的一種高密度RGD肽修飾材料的制備方法，其特征在于，所述步驟 (3) 活化試劑為羰基二咪唑、N-基羥基琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺的任一種。
5. 由權利要求1-4任一所述的一種高密度RGD肽修飾材料的制備方法制得的高密度 RGD肽修飾材料。
6. 由權利要求1-4任一所述的一種高密度RGD肽修飾材料的制備方法制得的高密度 RGD肽修飾材料的應用，該高密度RGD肽修飾材料應用于人體植入材料的制作，制成色譜填 料應用于中藥活性成分的篩選。
【專利摘要】本發明公開了一種高密度RGD肽修飾材料的制備方法及應用，將表面帶活性基團修飾的材料分散于甲苯中，加入催化量的4-二甲氨基吡啶，冰浴下緩慢滴加入三乙胺及2-溴異丁酰溴制得引發劑。向產物中加入溴化亞銅,2-2聯吡啶和聚乙二醇甲基丙烯酸酯得大分子聚合物。向反應物中加入活化試劑和4-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中，得活化的聚合物刷，加入RGD肽在室溫條件在避光反應18小時。將細胞移入至含RGD肽修飾的聚合物刷中，以磷酸鹽緩沖液為懸浮液，4℃下在搖床上反應20分鐘，即得到高密度RGD肽修飾材料。該方法反應條件溫和，步驟簡便易行，實現了將細胞高濃度、高密度地固定在固體材料表面的目的。
【IPC分類】A61L27-22, B01J20-26, C08F8-30, A61L27-18, C12N11-08, C08F120-28, A61L27-38, B01J20-281, B01J20-30
【公開號】CN104789547
【申請號】CN201510175638
【發明人】趙新鋒, 鄭曉暉, 于潔, 王世祥, 李倩
【申請人】西北大學
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月13日