采用Taqman探針法鑒定小麥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及植物病害檢測技術，特別是一種采用化qman探針法鑒定小麥黑穗菌 (TilletiacontroversaKilhn)的方法。
【背景技術】
[0002] 小麥矮腥黑穗病菌（Tilletiacontroversa肺hn，簡稱TCK)引起的小麥矮腥黑 穗病是一種重要的國際檢疫性病害，對小麥生產造成嚴重的危害，也是我國外來生物入侵 研究的主要物種之一（王圓，1997)。在其流行年份，小麥矮腥黑穗病引起的產量損失一般 為20 %~50 %，嚴重時可達75 %~90 %，甚至絕產。病菌抗逆性極強，其冬抱子在±中可 存活3~7年，包裹在菌瘦中的冬抱子甚至可保持活力長達10年W上。此病害一旦發生， 很難防治或根除，所W國際上有15個國家將其列為檢疫對象。我國在20世紀60年代把此 病害列為檢疫對象。在腥黑粉菌中，TCK與其近緣種小麥網腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌等在 形態學上極為相似，難于區別。
[0003] 傳統的病害診斷、檢測方法主要是依據病原形態學、生理學和生物化學的特性，不 但過程繁瑣、時間周期長，而且準確性差、精度不高。因此，利用分子生物學手段快速、準確 地鑒別小麥矮腥黑粉菌具有重要的意義。
[0004] 1996年化rreira等首次將PCR技術引進到印度腥黑穗病的鑒定中來，他們選擇 了印腥線粒體DNA的一個2. 3化的EcoRl片段進行了克隆和測序，設計的特異性引物TI1/ TI4從25種腥黑穗病菌菌株中鑒定出了印腥。另外，Smith等通過克隆印腥線粒體DNA的 化al片段，進行了序列分析，設計了兩套寡核巧酸引物對T117/M1和T117/M2能分別從印 腥中擴增出大小為825bp和118bp特異性片段，也實現了對印度腥黑穗病的檢測鑒定工作。 2000年化ederick根據線粒體的差異設計了 5對針對印度腥黑穗病的特異性引物和3對針 對黑麥草腥黑穗病的特異性引物，分別能將印度腥黑穗病菌株和黑麥草腥黑穗病菌株從其 近緣屬種中鑒別出來。張競宇等利用核糖體ITS序列上的差異在Tilletia屬20個種中設 計了一對特異性引物T1/T2,能將T.indica和T.walkeri從其它種中區分開來，而后又根 據T.indica和T.wa化eri線粒體之間的差異設計了一對特異性引物M1/M2,可W將二者區 分開來，為了使反應更為靈敏，建立了套式PCR技術，W便于提供更簡單的鑒定方法。2004 年高強利用RATO技術找到了一條可W將小麥網腥黑穗病菌株和小麥矮腥黑穗病菌株區別 于其它黑粉菌株的條帶，但是很遺憾在矮腥黑粉菌和網腥黑粉菌之間沒有找到有差異的條 帶，沒能將二者分開。梁宏等人依據核糖體的IGS1區特性，設計了一對特異性引物，可W將 小麥光腥黑穗病菌株從其近緣屬種中鑒別出來。
[0005] 發明人前期研究中獲得TCK差異片段66化p(SeqIDNo. 1)，并根據所得差異片段 獲得TCKScar標記及引物，見專利號201110051404.X記載。該標記能用于常規PC鑒定 TCK菌，能夠特異性地將TCK從近似菌種中鑒定出來。但是發明人發現，該專利中的標記引 物及PCR方法不能很好地應用于預警小麥矮腥黑穗病W及篩選抗TCK小麥品種方面，可能 是因為感染TCK且未表現病征的病株中，提取DM后，TCK的DM所占比例太小，也就是濃 度太低，而普通PCR的靈敏性不足于檢測到如此低濃度的模板。眾所周知，實時定量PCR在 靈敏度方面顯著優越于普通PCR，因此發明人嘗試將該專利中的Scar標記引物用于實時定 量PCR來擴增TCK樣本，但是無論是在實時巧光定量方法中還是在化qMan水解探針法定 量PCR中，從不同梯度的擴增曲線和標準曲線及溶解曲線來看，引物的特異性不好，標準曲 線的擴增效率遠遠超過正常的效率是90-110%，因此引物與模板擴增有問題。
[0006] 為了能順利利用實時定量PCR方法鑒定小麥矮星黑穗病，有必要通過設計篩選適 合于實時定量PCR方法的特異性PCR引物，優化PCR反應體系得出一套靈敏性高、特異性好 的實時定量檢測方法。
【發明內容】
[0007] 本發明根據上述領域的現狀及需求，根據前期研究中篩選到的TCK差異基因片段 SeqIDNo. 1，設計出TCK特異性引物及探針，基于AB口500巧光定量擴增儀，優化Real-Time PCR反應體系，成功地建立化qMan水解探針法定量PCR檢測體系檢測TCK和人工接種體系 下不同生長期小麥的感病情況檢測。
[0008] 本發明建立的實時定量化qman探針法檢測TCK的技術方案如下；
[0009] 用于鑒定小麥黑穗菌（Tilletiacontroversa肺hn)的化qman探針法，包括如下 步驟：
[0010] (1)獲得TCK陽性質粒標準品的實時定量標準曲線，其中Ct值為縱坐標，起始模板 拷貝數為橫坐標；
[0011] 似提取待測樣品的DNA;
[0012] (3)W所述待測樣品的DNA為模板進行實時定量PCR反應，
[0013] (4)根據所述實時定量PCR反應獲得的Ct值W及所述實時定量標準曲線得到所述 待測樣品中TCK的拷貝數；
[0014] 其特征在于；所述實時定量PCR反應采用的引物及探針如下：
[00巧]上游引物ACGACCGACTTTCCGAGAGC，
[0016]下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA;
[0017]hginan探針FAM5' -ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3'TAMAR。
[0018] 所述實時巧光定量PCR反應的體系如下；
[0019]
【主權項】
1. 用于鑒定小麥黑穗菌（TilletiacontroversaKUhn)的Taqman探針法，包括如下步 驟： (1) 獲得TCK陽性質粒標準品的實時定量標準曲線，其中Ct值為縱坐標，起始模板拷貝 數為橫坐標； (2) 提取待測樣品的DNA; (3) 以所述待測樣品的DNA為模板進行實時定量PCR反應， (4) 根據所述實時定量PCR反應獲得的Ct值以及所述實時定量標準曲線得到所述待測 樣品中TCK的拷貝數； 其特征在于：所述實時定量PCR反應采用的引物及探針如下： 上游引物ACGACCGACTTTCCGAGAGC， 下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA; Taqman探針FAM5' -ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3'TAMAR。
2.根據權利要求1所述的Taqman探針法，所述實時熒光定量PCR反應的體系如下：
加入滅菌蒸餾水至20yl。
3. 根據權利要求1所述的Taqman探針法，所述實時熒光定量PCR反應的體系程序如 下：95°C10 分鐘，95°C15 秒，60°C60 秒，40 個循環。
4. 用于鑒定小麥黑穗菌（TilletiacontroversaKUhn)的Taqman探針法試劑盒，其 特征在于：包括除DNA模板之外的用于實時熒光定量PCR反應的試劑和標準曲線方程說明 書； 所述試劑中的引物如下： 上游引物ACGACCGACTTTCCGAGAGC， 下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA; Taqman探針：FAM5' -ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3'TAMAR。 所述標準曲線方程為TCK陽性質粒標準品的實時定量標準曲線的方程，所述標準曲線 的縱坐標為Ct值，橫坐標為所述TCK陽性質粒標準品的起始模板拷貝數。
【專利摘要】本發明“采用Taqman探針法鑒定小麥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的方法及試劑盒”，涉及植物病害檢測技術。包括如下步驟：(1)獲得TCK陽性質粒標準品的實時定量標準曲線，其中Ct值為縱坐標，起始模板拷貝數為橫坐標；(2)提取待測樣品的DNA；(3)以所述待測樣品的DNA為模板進行實時熒光定量PCR反應，(4)根據所述實時熒光定量PCR反應獲得的Ct值以及所述實時定量標準曲線得到所述待測樣品中TCK的拷貝數；其特征在于：所述實時熒光定量PCR反應采用的引物如下：上游引物ACGACCGACTTTCCGAGAGC下游引物GTGTGGGACGAAGGCATCAA；Taqman探針FAM 5'-ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3'TAMAR，還提供了基于該方法的試劑盒。
【IPC分類】C12Q1-04, C12R1-645, C12Q1-68
【公開號】CN104774920
【申請號】CN201510018516
【發明人】高利, 陳萬權, 蔚慧欣, 劉太國, 劉博
【申請人】中國農業科學院植物保護研究所
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年1月14日