一種用于檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預后的生物標志物組合及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，設及一種用于檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預 后的生物標志物組合及其應用。
【背景技術】
[0002] 結直腸癌是一種原發于大腸的惡性腫瘤，包括結腸癌和直腸癌。結直腸癌因其發 部位不同而表現出不同的臨床癥狀及體征，主要有腹痛、便血、腹部包塊、腸梗阻等，伴或不 伴貧血、發熱和消瘦等全身癥狀。在我國，結直腸癌作為第=大腫瘤，其發病率及死亡率近 年來逐年上升。由于診斷技術的不斷提高，使新發結直腸癌病例中非轉移性疾病的比例大 大增加，對于該部分患者，外科手術及輔助化療是主要治療手段。但是目前尚缺乏有效的預 后判斷及化療療效評價指標。目前臨床上主要依據基于臨床病理指標（如腫瘤大小、淋己 結轉移數目、遠處轉移、組織分級等）的?m分期作為疾病預后的判斷及指導臨床治療，但 根據此分期判斷患者預后存在較大的異質性，亦不能預測腫瘤患者對化療的反應。
[0003] 研究表明II、111期結直腸癌患者經過標準治療后仍有20% -30%出現復發，其中 40 -50 %復發發生在原發灶切除后一年內，80 %復發發生在原發灶切除=年內，復發后5年 生存率低于1%。約有50%結直腸癌患者最終會進展為轉移性疾病而死亡。轉移性結直腸 癌患者僅有極少數可W經手術及化療而得到治愈，全身化療是該類患者的主要治療方法， W氣尿喀晚藥物為基礎聯合奧沙利銷或者伊立替康方案已成為晚期結直腸癌的標準治療 方案。此外，近年來抗血管生成藥物（貝伐珠單抗）或表皮生長因子單抗（西妥昔單抗或 帕巧單抗）聯合標準化療使有效率進一步提高，但有相當一部分病人在治療時出現化療藥 物耐藥甚至開始即出現不敏感最終因疾病進展而死亡。因此，篩選出對化療敏感的人群在 臨床實踐中顯得尤為重要，可使化療無效人群避免不必要的毒副作用及承擔巨大的經濟負 擔，但至今尚沒有有效的手段用于化療藥物敏感人群的選擇，尋求有效的標志物用于化療 敏感性指標具有極大的應用前景。
[0004] 微小核糖核酸（microRNA,miRNA)是一類長約19至23個核巧酸的非編碼單鏈小 核糖核酸分子，其主要功能是參與基因轉錄后水平調控。miRNA通過與祀mRNA3'端非 翻譯序列完全或部分互補結合，導致祀mRNA降解或轉錄后翻譯抑制從而調控祀基因的表 達。miRNA參與1/3人類蛋白編碼基因調控，它與多種生理活動有關，如生長發育、細胞增 殖、細胞調亡、細胞分化等；也與許多疾病的發生發展密切相關，如糖尿病、屯、血管疾病、月中 瘤等。最近的研究顯示h^33，miRNA在腫瘤發生、發展過程中發揮抑癌基因或癌基因樣作用。 已證實，腫瘤組織和腫瘤細胞中的某些miRNA表達水平發生了變化，相對于正常組織，一些 miRNA表達量顯著上升或下降。許多癌組織如肺癌、乳腺癌和食管癌等組織都有若干組織特 異性miRNA的表達，提示miRNA有腫瘤組織特異性。另外，miRNA的表達也與腫瘤分化程度 W及預后有關。最近，大量的研究結果揭示，miRNA在血清中能長期穩定存在，耐RNA酶的 降解，一些腫瘤包括非小細胞肺癌、結直腸癌、前列腺癌、卵巢癌和膜腺癌患者血清中miRNA 表達譜與正常人有顯著差異，均有各自特異的表達譜，同時該種變化還可見于早期癌中。該 種穩定存在于血清中的循環miRNA因其用于腫瘤等疾病的早期診斷、預后及療效判斷從而 指導個體化治療顯示出潛在的臨床應用前景。
[0005]目前尚沒有利用無創傷性、取材方便的血液標本檢測與轉移性結直腸癌化療療效 及預后生物標志物相關的特異性miRNA組合及檢測試劑盒。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的就在于通過對患者接受化療前的血清樣本miRNA進行檢測和比對， 分析miRNA表達水平與化療敏感性的關系，聯系患者的生存資料及治療效果，篩選一組與 轉移性結直腸癌化療療效及預后相關的血清miRNA,并利用該些miRNA的化qMan探針制備 出適用于臨床診療用途的試劑盒，為預測轉移性結直腸癌患者化療敏感性提供特異性的W 及迅速的無創傷性檢測手段。
[0007]W下是對本發明的進一步描述：
[0008] -種用于檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預后的miRNA組合，其包括下列 miRNA;miR- 13化及miR- 208b。
[0009] 上述miRNA組合的篩選方法包括W下步驟（見圖1):
[0010] (1)分別收集12例對奧沙利銷（F0LF0幻敏感和不敏感患者化療前混合血清樣本， 提取總RNA;
[0011] (2)采用高靈敏度、高精確性和高重復性的低密度巧片技術（TaqManlowdensity Arraytechnology)進行miRNAs檢測，篩選在化療敏感組（PR+SD)及不敏感組（PD)間穩定 差異表達的一組miRNA;
[0012] (3)用實時巧光定量PCR方法（TaqMan探針法）對一組標本進行逐個檢測，從低密 度巧片方法初篩出的miRNA中復篩出表達差異顯著miRNA;
[0013] (4)進一步用定量PCR方法對大批量標本進行逐個驗證，篩選出穩定的表達差異 顯著的一組miRNA。
[0014] 具體來說，上述篩選方法包括W下步驟；（1)收集接受奧沙利銷（F0LF0幻患者化 療前混合血清或血漿樣本，提取總RNA;(2)運用低密度巧片技術對上述RNA進行檢測，初篩 出在化療敏感組（PR+SD)及不敏感組（PD)間穩定差異表達的一組miRNA;(3)將抽提的RNA 逆轉錄為cDNA，采用巧光定量PCR訂aqMan探針法）對初篩出的miRNA進行復篩和驗證，挑 選出穩定、特異表達的一組miRNA。
[001引本發明使用的檢測方法可W選自；RT-PCR方法、低密度巧片技術（TaqManlow densityArraytechnology)、Real-timePCR方法中的一種或幾種。例如，血清中miRNA 分子的檢測方法包括W下步驟：
[0016] (1)使用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取血清總RNA;
[0017] (2)通過RNA逆轉錄反應得到cDNA;
[001引 （3)利用化qMan探針法進行PCR反應；
[0019] (4)進行PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳；
[0020] (5化B染色后在紫外燈下觀察結果。
[0021] 本發明還提供了一種用于檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預后的miRNA 化qMan探針組合物，包括miR- 13化和miR- 208b的化qMan探針。
[0022] 上述化qMan探針組合物優選包括W下序列所示的化qMan探針中的一種或多種：
[0023]
【主權項】
1. 一種用于檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預后的miRNA組合，其特征在于該 miRNA組合包括下列miRNA:miR- 135b和miR- 208b。
2. -種用于檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預后的miRNATaqMan探針組合物，其 特征在于該TaqMan探針組合物包括權利要求1所述miRNA的TaqMan探針。
3. 根據權利要求2所述的TaqMan探針組合物，其特征在于所述miRNA的TaqMan探針 序列為：SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2。
4. 權利要求1所述的miRNA組合在制備檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預后的試 劑或工具中的應用。
5. 權利要求1所述的miRNA組合在制備預測轉移性結直腸癌患者化療敏感性的試劑或 工具中的應用。
6. 權利要求2或3所述的TaqMan探針組合物在制備檢測轉移性結直腸癌化療療效和 /或預后的試劑或工具中的應用。
7. 權利要求2或3所述的TaqMan探針組合物在制備預測轉移性結直腸癌患者化療敏 感性的試劑或工具中的應用。
8. -種用于檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預后的試劑盒，其特征在于該試劑盒 包含權利要求2或3所述的TaqMan探針組合物。
9. 根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還可以包括Taq酶、dNTP、氯 化鎂和不含Mg2+的10XPCR緩沖液PCR緩沖液。
10. -種用于預測轉移性結直腸癌患者化療敏感性的試劑盒，其特征在于該試劑盒包 含權利要求2或3所述的TaqMan探針組合物。
【專利摘要】本發明涉及一種用于檢測轉移性結直腸癌化療療效和/或預后的生物標志物組合及其應用。所述miRNA組合包括：miR-135b、miR-208b。所述試劑盒包括上述miRNA的TaqMan探針組合。在本發明中，血清較易獲得，無需其它組織，屬于無創性檢查；血清miRNA反映的是機體整體的病理、生理情況，以其作為化療療效和預后標志物可以提高檢測的準確性；所述試劑盒簡化了TaqMan探針庫，減少制作成本和生產時間，增加了針對性和實用性，提高了檢測的靈敏度和特異性；所述組合、方法、試劑盒不僅能夠用于轉移性結直腸癌化療療效判斷，還能用于轉移性結直腸癌化療的預后判斷。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104774916
【申請號】CN201410794712
【發明人】張辰宇, 巴一, 曾科, 李佳璐, 陳熹
【申請人】南京大學
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2014年12月18日