一種具有抗菌活性的多肽Pt5e的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程藥物技術領域。設及一種具有中和內毒素作用的高磯蛋白衍 生多膚。其技術設及基因定點突變、重組表達、分離純化、重組多膚的抗菌功能、中和內毒素 功能W及細胞毒性分析技術。重組多膚在濃度1.2和1.8 時，可W完全抑制大腸桿菌 和金黃色葡萄球菌生長。重組多膚Pt5e能抑制炎癥因子TNF-a釋放，結合并中和內毒素， 保護內毒素血癥小鼠，保護率達60%W上，且無細胞毒性、無溶血副作用。
【背景技術】
[0002] 敗血癥是一種血液中毒病癥，主要是由身體某些部位感染的細菌擴散至血液，細 菌在血液中大量繁殖，產生內毒素（Lipoplysaccharide，LP巧，細菌內毒素主要通過兩個方 面發生作用；一方面為LI^S在細菌周圍形成一層保護屏障W逃避抗生素的作用；另一方面 LI^S作用于宿主細胞，誘導諸如TNF、IL等細胞因子的釋放，從而使機體處于混亂狀態，導致 過度炎癥，嚴重時引起人體多種器官功能受損、可導致脈毒性休克，使病人衰竭，最終死亡。 即使在美國該樣醫療水平高度發達的國家，每年仍有超過200, 000人死于敗血癥。因此，敗 血癥是常見而又嚴重的臨床疾病，對患者生命威脅、危害極大。
[0003] 敗血癥的治療最主要在于阻斷、遏制和消除內毒素作用。目前，治療敗血癥主要依 靠抗生素結合其他輔助方法來實現。迄今，臨床上還缺乏一種可W特異性中和內毒素而沒 有副作用的藥物。即使新近生產的抗內毒素抗體和血液凈化方法等，臨床上療效也不甚明 顯〇
[0004] 抗菌膚由于具有廣譜抗菌活性和結合內毒素、阻止炎癥因子釋放等抗菌作用，W 及對正常細胞無損傷等作用。近年來已經成為理想的治療敗血癥候選藥物。例如，抗菌 膚化-37不但可W結合并中和內毒素，而且具有治療敗血癥作用，能明顯提高成活率。但 是，化-37具有溶血副作用，極大地限制了其在臨床上的應用。但不容忽視的是抗菌膚已 成為未來對抗內毒素的主要研究對象。我們發現，通過定點突變、重組表達的高磯蛋白 (地osvitin)衍生抗菌多膚Pt5e，不但具有廣譜抗菌作用、可W結合內毒素，而且能夠抑制 炎癥因子釋放、顯著提高內毒素血癥小鼠成活率，而無細胞毒性和溶血作用發生，因此是一 種具有良好前景的治療敗血癥的藥物。
【發明內容】
[0005] 本發明是發現了一種可用于治療敗血癥的新型抗菌膚Pt5e，及其設計和制備技 術。抗菌膚原始序列來源高磯蛋白基因，我們采用定點突變和重組表達制備高磯蛋白衍生 抗菌多膚Pt5e，并中和內毒素功能W及細胞毒性分析，驗證了Pt5e應用于敗血癥治療的可 行性。
[0006] 本發明更詳細的實施方法可參見實施例。
【附圖說明】
[0007]圖1;高磯蛋白與其C-端55個氨基酸組成多膚Pt5。示由P巧經定點突變，獲得 重組表達突變體流程。
[000引圖2 ;重組表達多膚電泳（A)和免疫印跡炬）。M，標準蛋白；Lane1，重組表達 多膚Pt5;Lane2，重組表達多膚Pt5a;Lane3，重組表達多膚P巧b;Lane4，重組表達 多膚Pt5c;Lane5，重組表達多膚Pt5d;Lane6，重組表達多膚Pt5e;Lane7，重組表達 多膚Pt5f。
[0009] 圖3;透射電鏡結果。示PBS(A、C)或者Pt5e炬、D)與公.。〇"^及5： 在25°C共育1小時對細菌的影響。
【具體實施方式】
[0010] (1)定點突變W及重組蛋白表達與純化 基于P巧序列，設計特定的系列引物制作6個突變體Pt5a、P巧b、Pt5c、P巧tPt5e和P巧f。采用定點突變獲得高磯蛋白衍生多膚Pt5e，構建表達載體導入大腸桿菌誘導表達，突 變體在C(97i，經親和層析純化，得電泳純多膚。
[0011] 多膚Pt5、Pt5a、P巧b、Pt5c、P巧d、Pt5e和Pt5f的DNAW及氨基酸序列見序列表， 其中P巧的核巧酸和氨基酸序列標識符為1 ;P巧的純氨基酸序列標識符為2 ;P巧a的核 巧酸和氨基酸序列標識符為3 ;P巧a的純氨基酸序列標識符為4 ;P巧b的核巧酸和氨基酸 序列標識符為5 ;P巧b的純氨基酸序列標識符為6 ;P巧C的核巧酸和氨基酸序列標識符為 7 ;P巧C的純氨基酸序列標識符為8 ;P巧d的核巧酸和氨基酸序列標識符為9 ;P巧d的純氨 基酸序列標識符為10 ;P巧e的核巧酸和氨基酸序列標識符為11 ;P巧e的純氨基酸序列標 識符為12 ;P巧f的核巧酸和氨基酸序列標識符為13 ;P巧f的純氨基酸序列標識符為14。
[0012] (2)重組多膚具有廣譜抗菌作用 先導實驗采用微量稀釋分析法（microdilutionassay)分析6個重組多膚抗菌活性， 發現其中Pt5e抗公.co7i和5： 餅W活性最強，最小抑菌濃度分別為1. 2和1. 8yM，比 其母分子P巧抑菌作用還強大。因此，我們選擇Pt5e進行下面實驗。分析Pt5e抗革藍氏 陰性細菌公.C(97i和K<3/7卵i77aru誠iv及革藍氏陽性細菌awe化、公.況和必 作用，發現Pt5e可W顯著抑制各種所測試細菌的生長，具有廣譜抑菌活性。Pt5e抗 菌活性具有熱穩定性，其作用100度處理10分鐘，不會受到影響。
[0013] (3)Pt5e破壞細菌細胞壁 采用流式細胞儀和電子顯微鏡分析Pt5e對公.co7i和5： 化細胞影響。結果表 明；Pt5e可W造成公.co7i和5： 化細胞壁損傷，使細胞壁變薄甚至造成細胞壁破壞， 失去完整性。Pt5e還可W造成細胞質流出細胞外。
[0014] (4 )Pt5e結合LI^S和LTA 免疫酶標法（ELISA)分析重組表達多膚Pt5e與LI^S和LTA的結合。結果表明；Pt5e可W與革藍氏陰性細菌表面保守分子LI^S結合，也可W與革藍氏陽性細菌表面保守分子LTA 務主厶 臺口口 〇
[0015] (5) Pt5e抑制LPS-處理的RAW264. 7細胞分泌TNF-a LPS處理大鼠巨瞻細胞RAW264. 7會分泌炎癥因子TNF-a。我們發現；Pt5e可W顯著抑 制LPS處理的大鼠巨瞻細胞RAW264. 7分泌TNF-a，該證明Pt5e具有中和內毒素的功能。
[0016] (6 )Pt5e對RAW264. 7 細胞無毒性 采用MIT法測試重組表達多膚Pt5e對RAW264. 7細胞成活率影響。結果表明；Pt5e對 大鼠RAW264. 7生長沒有影響，對大鼠RAW264. 7細胞無毒性。
[0017] (7)Pt5e對人血紅細胞沒有破壞作用 溶血作用分析表明；重組表達多膚Pt5e對人人血紅細胞無毒，不會造成血紅細胞溶 解，沒有溶血作用。
[001引（8)Pt5e保護內毒素血癥小鼠 采用內毒素血癥小鼠模型研究重組表達多膚Pt5e對其保護作用。結果表明；Pt5e可W保護體內注射LI^S誘導的內毒素血癥小鼠，使其死亡率顯著降低，保護率可達60%W上。 [001引表1 ;定點突變所用的引物。
【主權項】
1. 一種具有抗菌活性的高磷蛋白衍生多肽Pt5e，其特征在于編碼的DNA核苷酸序列 為： Tctcgtatgtctaagactgccaccatcattgagcctttcaggaaattccacaaagatcggtacttggcaca ccatagcgccacaaaggatactagcagtggaagtgctgcagctagctttgaacaaatgcagaaacagaatctatt ccttggaaatgatattcca； 其氨基酸序列為： SRMSKTATIIEPFRKFHKDRYLAHHSATKDTSSGSAAASFEQMQKQNLFLGNDIP； 所述的高磷蛋白衍生多肽Pt5e，具體是利用基因定點突變，構建表達載體導入大腸桿 菌誘導表達；通過親和層析純化重組表達多肽。
2. 權利要求1所述高磷蛋白衍生多肽Pt5e，其特征在于其具有廣譜抗菌作用可用于治 療敗血癥。
【專利摘要】本發明發現了一種新型具有中和內毒素作用的重組抗菌多肽的設計、重組表達和制備技術。該技術采用定點突變、表達載體構建、誘導表達和親和層析，分離純化重組多肽。高磷蛋白衍生抗菌多肽Pt5e具有廣譜抗菌作用；中和內毒素作用；抑制炎癥因子TNF-α分泌；并能顯著提高內毒素血癥小鼠成活率，且無細胞毒和溶血等副作用，是一種具有良好應用前景的治療敗血癥的藥物。應用該技術可以生產新型中和內毒素抗菌多肽，成本低，對環境無污染。
【IPC分類】C12N15-12, A61P7-04, C07K14-46
【公開號】CN104774842
【申請號】CN201510138106
【發明人】張士璀, 胡立立, 宿烽
【申請人】青島科技大學
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年3月27日