一種分離骨髓單個核細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及一種分離骨髓單個核細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 骨髓中單個核細胞包括造血干細胞化SC)、骨髓間充質干細（MSCs)、內皮細胞 巧PC)、和基質細胞等多種細胞的混合體。就目前而言，骨髓單個核細胞中的造血干細胞已 用于移植術并大量運用于臨床治療各種血液疾病且取得了很好的療效。近年來大量實驗研 究證明骨髓中也含有一定數量的骨髓間充質干細胞炬MSCs)，所述骨髓間充質干細胞是指 一群可向成骨細胞、成脂細胞、骨髓基質細胞、肝臟細胞、神經細胞等多種細胞分化的多潛 能組織干細胞，具有W下優點；（1)體外易獲得、易分離培養，增殖快；（2)具有獨特的免疫 學特性；不表達MHCII類分子和共刺激分子B7-1、B7-2,故不能刺激機體產生免疫反應； 將BMSCs輸入體內之后不會被排斥，可W在宿主體內長期存活；（3)具有誘導免疫耐受的潛 力；（4)易于基因操作，組織相容性好；（5)不受倫理學限制。因此，BMSCs成為近年來細胞 治療和細胞工程中的首選種子細胞，有著廣闊的應用前景。其陽性表面標志為甜-2、CD44\ CD7r、CD90、和CD106,目前認為典型標記為CD44\CD7r。目前用于分離骨髓間充質干細胞 的方法有；貼壁篩選法、密度梯度離屯、法、流式細胞儀法和免疫磁珠法。由于流式細胞儀法 對細胞損傷較大，免疫磁珠法價格相對較高，因此現實中多采用密度梯度離屯、法和貼壁篩 選法結合使用，W提高所得BMSCS的純度。
[0003] 但目前對骨髓單個核細胞的分離方法報道還不多，國內外常用的方法為Ficoll 一步法。由于應用此方法離屯、后部分紅細胞仍懸浮于Ficoll溶液中致使收集的MNCs可能 混雜紅細胞，不利于MNCs收集。因而尋找一種更為簡便高效的MNCs分離培養方法具有十 分重要的現實意義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的之一在于針對現有技術的不足，設計研發一種新型分離骨髓單個核 細胞的方法。所述方法利用明膠溶液可W破壞紅細胞表面電荷而加速紅細胞的沉積，對其 他主成分包括單個核細胞無影響該一點W及骨髓中單個核細胞與其他成分存在密度差異， 利用淋己細胞分離液作密度梯度離屯、時各種細胞成分按密度梯度重新分布聚集，從而獲得 單個核細胞該一原理進行骨髓中單個核細胞的分離。利用本方法分離骨髓單個核細胞不會 增加MNCs的損失，且能更好地保留骨髓造血干細胞和骨髓間充質干細胞，操作簡單方便， 可進行臨床推廣。
[0005] 本發明提供一種分離骨髓單個核細胞的方法，包括如下步驟：
[0006] 步驟1 ;取骨髓液與明膠混勻，自然沉降一段時間。
[0007] 步驟2;取步驟1中得到的明膠懸液層進行離屯、分離操作，棄去上清液，加入 PRMI1640培養液重懸細胞。
[0008] 步驟3 ;取步驟2中得到的重懸細胞液與低糖DMEM培養液混勻，緩慢加入到 Ficoll溶液表面，室溫下進行離屯、分離操作。
[0009] 步驟4 ;離屯、完畢后，小屯、吸取步驟3中得到的混懸液中層云霧狀細胞層，用PBS 洗漆后進行離屯、分離操作，W含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液配成一定濃度的懸液，即 得。
[0010] 進一步地說，所述步驟1中的明膠的質量百分比為3%，骨髓液與明膠的體積比為 1 : 1，沉降時間為比。
[0011] 進一步地說，所述步驟2中的離屯、分離操作參數為取350g明膠懸液層離屯、分離 8min。
[0012] 進一步地說，所述步驟3中的重懸細胞液與低糖DMEM培養液及Ficoll溶液的體 積比為1 : 1 : 2,離屯、分離操作參數為取800g上述混懸液離屯、分離20min。
[0013] 進一步地說，所述步驟4中的用PBS洗漆次數為2~3次，離屯、分離操作參數為取 上述用PBS洗漆后的混懸液中層云霧狀細胞層600g離屯、分離5min，配制懸液濃度為1X1〇6 個/ml。
[0014] 本發明的有益效果在于；利用本發明的方法分離骨髓單個核細胞不會增加MNCs 的損失，且能更好地保留骨髓造血干細胞和骨髓間充質干細胞，操作簡單方便，可進行臨床 推廣。
【具體實施方式】
[0015] 本發明提供一種分離骨髓單個核細胞的方法，包括如下步驟：
[0016] 步驟1 ;取骨髓液與明膠混勻，自然沉降一段時間。
[0017] 步驟2;取步驟1中得到的明膠懸液層進行離屯、分離操作，棄去上清液，加入 PRMI1640培養液重懸細胞。
[001引步驟3 ;取步驟2中得到的重懸細胞液與低糖DMEM培養液混勻，緩慢加入到Ficoll溶液表面，室溫下進行離屯、分離操作。
[0019] 步驟4 ;離屯、完畢后，小屯、吸取步驟3中得到的混懸液中層云霧狀細胞層，用PBS 洗漆后進行離屯、分離操作，W含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液配成一定濃度的懸液，即 得。
[0020] 進一步地說，所述步驟1中的明膠的質量百分比為3%，骨髓液與明膠的體積比為 1 : 1，沉降時間為比。
[0021] 進一步地說，所述步驟2中的離屯、分離操作參數為取350g明膠懸液層離屯、分離 8min。
[0022] 進一步地說，所述步驟3中的重懸細胞液與低糖DMEM培養液及Ficoll溶液的體 積比為1 : 1 : 2,離屯、分離操作參數為取800g上述混懸液離屯、分離20min。
[0023] 進一步地說，所述步驟4中的用PBS洗漆次數為2~3次，離屯、分離操作參數為取 上述用PBS洗漆后的混懸液中層云霧狀細胞層600g離屯、分離5min，配制懸液濃度為1X1〇6 個 /ml。
[0024] 下文將結合具體實施例對本發明進行詳細描述。應當注意的是，下述實施例中描 述的技術特征或者技術特征的組合不應當被認為是孤立的，它們可W被相互組合從而達到 更好的技術效果。
[0025] 標本來源：選擇健康志愿者30人，男15人，女15人。年齡25~45歲。無菌條件 下行骼后上崎抽取骨髓液40mU肝素抗凝。標本采集后立即分離MNCs。
[0026] 實施例1
[0027] Ficoll-步法分離MNCs
[00測取骨髓液20血與等量的低糖DMEM培養液（購買于美國invitrogen公司）混合。 混合均勻后，緩慢加入到等量的Ficoll溶液液面上。室溫下進行離屯、分離（離屯、分離操作 參數為800g，20min)。離屯、分離完畢后，小屯、吸取中層云霧狀細胞層，用PBS洗兩次后再次 進行離屯、分離（離屯、分離操作參數為600g，5min)。化含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液 配成濃度為1X106mm0l/L的懸液備用，然后作MNCs計數及采用臺盼藍拒染法檢測其活力。
[0029] 實施例2
[0030] 明膠-Ficoll兩步法分離MNCs
[0031] 取20血骨髓液與等量3%明膠（購買于美國SIGMA公司）混勻后自然沉降比，取 明膠懸液層進行離屯、分離（離屯、分離操作參數為350g，8min)，棄去上清液，加入PRMI1640 培養液（購買于美國Hyclone公司）重懸細胞，然后參照Ficoll-步法分離MNCs。
[0032] 實施例3
[0033] 流式細胞術檢測MNCs表面CD34+和CD44 7CD7r
[0034] 取MNCs懸液2血離屯、洗漆2次，用PBS調整濃度至5X106個/ml,取上述細胞懸 液lOOuL分別加入相應抗體后，避光4°C解育30min。
[0035] 所述抗體加入量如下表：
[0036] 表1加入的抗體名稱及其含量
[0037]
【主權項】
1. 一種分離骨髓單個核細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟1:取骨髓液與明膠混勻，自然沉降一段時間； 步驟2 :取步驟1中得到的明膠懸液層進行離心分離操作，棄去上清液，加入PRMI1640 培養液重懸細胞； 步驟3 :取步驟2中得到的重懸細胞液與低糖DMEM培養液混勻，緩慢加入到Ficoll溶 液表面，室溫下進行離心分離操作； 步驟4 :離心完畢后，小心吸取步驟3中得到的混懸液中層云霧狀細胞層，用PBS洗滌 后進行離心分離操作，以含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液配成一定濃度的懸液，即得。
2. 如權利要求1所述的一種分離骨髓單個核細胞的方法，其特征在于，所述步驟1中的 明膠的質量百分比為3%，骨髓液與明膠的體積比為1 : 1，沉降時間為lh。
3. 如權利要求1所述的一種分離骨髓單個核細胞的方法，其特征在于，所述步驟2中的 離心分離操作參數為取350g明膠懸液層離心分離8min。
4. 如權利要求1所述的一種分離骨髓單個核細胞的方法，其特征在于，所述步驟3中的 重懸細胞液與低糖DMEM培養液及Ficoll溶液的體積比為I: 1 : 2,離心分離操作參數為 取800g上述混懸液離心分離20min。
5. 如權利要求1所述的一種分離骨髓單個核細胞的方法，其特征在于，所述步驟4中的 用PBS洗滌次數為2~3次，離心分離操作參數為取上述用PBS洗滌后的混懸液中層云霧 狀細胞層600g離心分離5min，配制懸液濃度為IXIO6個/ml。
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種分離骨髓單個核細胞的方法。所述方法利用明膠溶液可以破壞紅細胞表面電荷而加速紅細胞的沉積，對其他主成分包括單個核細胞無影響這一點以及骨髓中單個核細胞與其他成分存在密度差異，利用淋巴細胞分離液作密度梯度離心時各種細胞成分按密度梯度重新分布聚集，從而獲得單個核細胞這一原理進行骨髓中單個核細胞的分離。利用本發明的方法分離骨髓單個核細胞不會增加MNCs的損失，且能更好地保留骨髓造血干細胞和骨髓間充質干細胞，操作簡單方便，可進行臨床推廣。
【IPC分類】C12N5-0789, C12N5-0775, C12N5-071
【公開號】CN104774805
【申請號】CN201510156170
【發明人】銀廣悅, 楊洪濤, 丁俊麗, 劉繼勇, 周志偉, 孫巖, 徐翠玲, 武彩虹, 汪方圓, 張龍
【申請人】銀廣悅
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月3日