兒茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特異性抗體和檢測試劑及制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，設及兒茶酪胺免疫原、衍生物及合成方法、特異性抗體 和檢測試劑及制備方法。
【背景技術】
[000引兒茶酪胺（catecholamine)是一類由酪氨酸衍生而來，含有兒茶酪和胺基的小分 子物質的統稱，常見的兒茶酪胺類物質主要包括腎上腺素（epine地rine，E)、去甲腎上腺素 (nor巧in巧虹ine,肥）和多己胺（dopamine,DA)等（結構式如式1所示）。在人體內，兒茶 酪胺類物質主要由腎上腺髓質和交感神經元的嗜銘細胞所分泌，作為一類重要的神經遞質 和激素，在人體中具有重要的生理作用，對屯、血管系統、神經系統、內分泌腺、腎臟、平滑肌 等組織器官具有廣泛的調節作用。其中多己胺在大腦和神經信號傳導中起著十分重要的作 用，可W提高神經系統反應速度，增強機體適應環境的能力。
[0003]多種疾病會導致兒茶酪胺類物質的分泌和代謝異常，如嗜銘細胞瘤、副神經節瘤、 神經母細胞瘤和腎上腺髓質增生等疾病。該些疾病患者體內兒茶酪胺的濃度會發生異常變 化，進而影響與兒茶酪胺相關生理功能的正常實現。此外，體液中兒茶酪胺水平還與高血 壓、更年期綜合征等有著密切的關系。因此，檢測血漿和尿液中兒茶酪胺類物質的濃度對于 該些疾病的臨床診斷和治療W及藥物藥理作用的研究均具有重要意義。
[0004]
【主權項】
1. 一種兒茶酚胺免疫原，其結構式如式（I)所示：
式中，R為連接基團-(CH2)n-C00-，n是1至20之間的整數；載體為具有免疫原性的蛋 白質或多肽，選自血清蛋白、血藍蛋白或甲狀腺球蛋白中的一種。
2. -種如權利要求1所述的兒茶酚胺免疫原的制備方法，其特征在于包含以下步驟： ⑴將載體蛋白200mg溶解于50ml0? 2M，pH8. 5的磷酸緩沖液中； (2) 將如下化學品加入到小燒杯中攪拌溶解：200mg兒茶酚胺衍生物、3. 5ml二甲基甲 酰胺、3. 5ml乙醇、7. 0ml10mM，pH5. 0的磷酸鉀緩沖液、200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙 基）碳二亞胺、50mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺，將這些化學品在室溫下攪拌溶解反應30min; (3) 將溶解好的溶液滴加至載體蛋白溶液中，并在2~8°C下攪拌過夜，得到抗原；將合 成好的抗原經過透析進行純化，得到兒茶酚胺免疫原。
3. -種兒茶酚胺衍生物，結構式如式（II)所示：
上述R為連接基團-(CH2)n-C00-，n為1至20之間的整數。
4. 根據權利要求3所述的兒茶酚胺衍生物的制備方法，其特征在于，取n= 3時，兒茶 酚胺衍生物的合成步驟如下：
或者，當n為3以外的其余整數時，兒茶酚胺衍生物的合成步驟與上述合成步驟的區別 僅在于：由化合物2合成化合物3的步驟中，采用的原料4-溴丁酸乙酯替換為2-溴乙酸乙 酯、3-溴丙酸乙酯或其余類似物。
5. -種抗兒茶酚胺特異性抗體，由權利要求1所述的兒茶酚胺免疫原免疫實驗動物后 產生的完整抗體分子，或者為保留與兒茶酚胺特異性結合能力的抗體片段或抗體衍生物。
6. 根據權利要求5所述的一種抗兒茶酚胺特異性抗體，其特征在于所述的完整的抗體 分子、抗體片段或抗體衍生物，為采用單一的兒茶酚胺免疫原對動物加強免疫所獲得的多 克隆抗體，或者為免疫后經體細胞雜交獲得的單克隆抗體；所述的實驗動物為兔、山羊、小 鼠、綿羊、豚鼠或馬的一種。
7. -種如權利要求5或6所述的抗兒茶酚胺特異性抗體的制備方法，其特征在于包含 以下步驟： (1) 用PBS將連接有牛血清白蛋白的兒茶酚胺免疫原稀釋至1.Omg/ml，得到抗原溶液， 然后用1. 0ml抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對實驗動物進行注射； (2) 2~3周后，再用1. 0ml相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對上述實驗動物注射一 次，之后每隔四周注射一次，共計注射4次； (3) 對步驟（2)的實驗動物取血，分離純化得到效價為1:30000-1:50000的抗兒茶酚胺 特異性抗體。
8. -種兒茶酚胺檢測試劑，含有權利要求5或6所述的抗兒茶酚胺特異性抗體和指示 試劑，所述的指示試劑選自酶試劑；所述的酶試劑由兒茶酚胺酶標偶聯物和酶的底物組成， 酶標偶聯物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物，酶的底物為葡萄糖-6-磷酸。
9. 一種如權利要求8所述的兒茶酚胺檢測試劑的制備方法，其特征在于包含以下步 驟： (1) 試劑A:將4. 036g、ll. 25mM氧化態的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和1. 711g、ll. 25mM葡 萄糖-6-磷酸用1L55mM、pH= 8. 0的Tris緩沖液溶解制成均相酶底物；將權利要求5-7 中任一項所述的抗兒茶酚胺特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗兒茶酚胺特異性抗體與 均相酶底物的體積比為1:100~1:10000 ; (2) 試劑B:將兒茶酚胺酶標偶聯物加到120mM、pH= 8. 2的Tris緩沖液中，兒茶酚胺 酶標偶聯物與Tris緩沖液的體積比為1:100~1:10000。
10. 根據權利要求8所述的兒茶酚胺檢測試劑的制備方法，其特征在于所述的兒茶酚 胺酶標偶聯物的制備方法包含以下步驟： (1) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液的制備：稱取15mg規格為100KU的葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶，室溫溶解于 12mL含有 72.6mg0.05MTris、8mg3.3mMMgClJPlOOmgNaCl的溶液 中，pH= 9. 0 ;在溶液中加入225mg還原態的煙酰胺腺嗓呤二核苷酸、135mg葡萄糖-6-磷 酸以及0. 75mL卡必醇；再逐滴加入2mL二甲基亞砜； (2) 兒茶酚胺衍生物的激活：在無水狀態下稱取10mg兒茶酚胺衍生物，溶解于600yL 二甲基甲酰胺中；使上述溶液溫度降到-2~-8°C;加入3yL三丁胺；加入1. 5yL氯甲酸 異丁酯；-2~-8°C攪拌30分鐘； (3) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與兒茶酚胺衍生物的連接：將步驟（2)激活的兒茶酚胺衍 生物溶液逐滴加入到步驟（1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液中；2-8°C攪拌過夜； (4) 純化產物：通過G-25凝膠層析柱純化連接產物，獲得的最終產物為葡萄糖-6-磷 酸脫氫酶-半抗原偶聯物，于2-8 °C下儲存。
【專利摘要】本發明公開了一種兒茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特異性抗體和檢測試劑及制備方法。本發明制備的兒茶酚胺免疫原，免疫原性高，可以誘導得到高效價的抗兒茶酚胺特異性抗體，并且與常見的62種藥物無任何交叉反應；由該抗體制備得到的兒茶酚胺檢測試劑，可以精確快速地確定樣品中的兒茶酚胺含量。與市場上現有的檢測試劑比較，本發明檢測試劑具有操作簡便、靈敏度高、特異性強、結果準確等優點，還能有效降低兒茶酚胺檢測成本，有利于臨床大規模推廣使用。
【IPC分類】C07K14-765, C07C213-02, C07K14-795, C07K16-44, G01N33-53, C07K14-435, C07C217-60
【公開號】CN104774256
【申請號】CN201510236349
【發明人】虞留明, 顏光濤, 洪天配, 邱玲
【申請人】蘇州博源醫療科技有限公司
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年5月11日