與整合素受體ανβ3相關的5肽的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程制藥技術領域和蛋白質多肽類藥物及生物醫學工程領域，具體涉及針對整合素受體α νβ 3具有高親和力多肽及其應用，例如用于癌癥診斷和治療中。
【背景技術】
[0002]目前，癌癥已經成為引起人類死亡的主要原因之一，而化療仍然是治療癌癥的主要方法，但是，由于傳統的化藥缺少針對腫瘤細胞的特異性，導致了對病人的一些器官毒性。
[0003]整合素在體內細胞中都有廣泛的表達，大多數細胞表面都可表達一種以上的整合素，這些整合素不僅參與著一些細胞的生長、分化及凋亡等生理功能，而H在多種病理過程中也發揮著極為重要的作用。整合素家族包括18種α亞型和8種β亞型，而α β亞型的配對決定了配體的特異性。整合素超級家族中，整合素受體ανβ 3在成像與靶向治療中起著主要的作用。由于整合素受體ανβ 3在多種腫瘤如膠質瘤，乳腺癌，黑色素瘤，前列腺癌及卵巢癌中都是高表達的，因此整合素受體ανβ 3成為比較重要的藥物靶點。目前3肽(序列為精氨酸-色氨酸-精氨酸)是證明對整合素ανβ 3具有高親和力的多肽(詳見專利:與整合素α νβ 3受體具有高親和力的多肽，申請號201310019870.9)。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供能夠與整合素受體α νβ 3相關的靶向多肽，使其能夠對整合素受體α νβ 3高表達的腫瘤進行診斷。
[0005]本發明所述的5肽是在3肽基礎上由5個氨基酸組成，其具有精氨酸-色氨酸-精氨酸-天冬酰胺-蛋氨酸的氨基酸序列。
[0006]為了檢測本發明多肽的藥理活性，體外實驗通過熒光染料羅丹明B對多肽進行標記，以檢測其對腫瘤的靶向性。在體外細胞親和力實驗和攝取實驗中，本發明的5肽展現出了其良好的對腫瘤細胞整合素受體ανβ3的靶向能力，且能力強于3肽。在體外細胞毒性實驗中，本發明的5肽為表現出對細胞的毒性。
[0007]下面是本發明部分藥效學實驗:
[0008]一、標記熒光染料
[0009]本發明應用于體外細胞實驗的熒光染料為羅丹明B(Rhodamine 8)，簡稱他8，分別與上述3肽，及本發明5肽通過酰胺鍵連接，簡稱分別為RWr-RhB與RWrNM-RhB，連接方法具體為取Img羅丹明B(詳見參考文獻:Cao，J.，et al.，Fast clearing RGD-basednear-1nfrared fluorescent probes for in vivo tumor diagnosis.Contrast MediaMol Imaging, 2012.7(4):p.390-402)溶于 Iml PBS (pH 為 7.4)中，加入 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)(摩爾比RhodamineB: EDC: NHS = I: 1.5: 1.5)，避光反應4h，活化。分別稱取Immol 3肽及5肽溶入含有熒光染料羅丹明B的Iml PBS緩沖液(pH7.4)中，室溫避光攪拌過夜。反應結束后，反應液濃縮后通過葡聚糖凝膠G-25柱，PBS緩沖液(pH7.4)作洗脫液，得到純化的RWr-RhB及RWrNM-RhB，_20°C儲存備用。環狀RGD作為對照也使用相同的方法標記簡稱為c(RGDyK)-RhB0
[0010]二、體外細胞親和力實驗
[0011 ] 將培養好的人腦膠質瘤U87MG細胞從12孔板上洗脫后重懸于PBS溶液，分別與羅丹明B標記的3肽，5肽(500umol/L)共孵育2小時，并通過流式細胞術檢測其平均熒光強度，熒光強度越強證明對細胞的親和力越強。當探針與細胞上的受體親和力強時，流式細胞儀檢測出的細胞平均熒光強度值高。體外親和力實驗結果顯示濃度相同的標記了 RhB的3肽，5肽的探針分別與整合素受體高表達的U87MG細胞孵育后，在U87MG細胞中3肽探針平均熒光強度為98，5肽探針平均熒光強度為123，空白染料平均熒光強度為25，結果表明這些探針在與U87MG細胞親和力強弱對比中，本發明5肽的強度最大。
[0012]三、體外細胞攝取實驗
[0013]將培養好的人腦膠質瘤細胞U87MG，人乳腺癌細胞MDA-MB-231，人乳腺癌細胞MCF-7和正常肝細胞L02轉移到共聚焦皿中，過夜孵育后分別加入相同濃度的羅丹明B標記的5肽(500umol/L)，加入羅丹明B標記的環狀RGD作為陽性對照，37°C孵育2小時后，加入染核試劑12 μ g/mL Hochest33342染色，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內探針的攝取情況。在整合素受體α V β 3高表達的U87MG和MDA-MB-231細胞中(圖1所示)，環狀RGD和5肽探針顯示出了很強的熒光強度，而在整合素受體α V β 3低表達的MCF-7和L02細胞(圖2所示)，這兩種探針的熒光強度不強，這一結果說明5肽探針對整合素受體α V β 3高表達的細胞有靶向性而對整合素受體α νβ 3低表達的細胞靶向性不強。
[0014]四、體外細胞毒性實驗
[0015]U87MG細胞、MCF-7細胞與正常肝L02細胞，待長至90%以上時，用0.25%胰蛋白酶液消化后，制備成單細胞懸液(完全生長培養基)，以3000個細胞/孔鋪96孔板，于37°C，含5% 0)2的培養箱中培養，在培養24h后換為1% FBS的低血清培養液，然后加入不同濃度梯度的5肽，使他們的終濃度為2.5，5，10，20，40，80，100和200 μ Mo結果顯示(圖3所示)5肽對這幾種細胞的存活率均在80%以上，說明5肽對這些細胞基本無毒。
[0016]綜上所述，本發明的5肽能夠靶向到整合素受體α νβ 3高表達的細胞上，而對整合素受體α V β 3低表達的細胞基本無靶向性，并且5肽對細胞基本無毒性。由此可見5肽能夠成為對整合素受體α νβ 3高表達腫瘤進行體外診斷。
[0017]本發明的5肽可以優選用實施例1固相合成的方法制備。
【附圖說明】
[0018]圖1激光共聚焦細胞攝取實驗觀察羅丹明B標記的探針對不同腫瘤細胞的攝取(Α為U87MG細胞，B為MDA-MB-231細胞)
[0019]圖2激光共聚焦細胞攝取實驗觀察羅丹明B標記的探針對不同腫瘤細胞的攝取(A為MCF-7細胞，B為L02細胞)
[0020]圖3體外細胞毒性實驗考察5肽對不同細胞的毒性【具體實施方式】
[0021]實施例1
[0022]5肽的合成
[0023]1:偶聯
[0024]先將Fmoc-Met-Rink amide MBHA resin (荷甲氧幾酰基-苯丙氨酸-rink氨基樹脂)0.33/2mmol6.06g溶脹于二甲基甲酰胺中，10ml/g樹脂，接著用20 %六氫吡啶/ 二甲基甲酰胺溶液脫去Fmoc保護基(以下稱之為脫帽)，用二甲基甲酰胺洗滌脫帽子后的樹脂，加入原料Fmoc-Asn (tBU)-OH 2.3g，縮合劑用HBTU 1.44g，反應時間30分鐘，kaiser法檢測，如檢測結果為陰性，說明偶聯反應完成，則接下去進行脫帽，時間30分鐘，如檢測結果仍為陽性，則說明偶聯反應未完成或反應不完全，需要延長偶聯時間或重新投料偶聯，直至偶聯反應完成。重復上述操作，依次偶聯；Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH ；Fmoc-Trp-OH ；Fmoc-Arg(Pbf) -OH,完成所有直鏈肽合成后，用甲醇洗滌所得到的peptidyl resin,真空干燥箱里充分干燥。
[0025]2:樹脂與肽的分離裂解
[0026]將120ml裂解液(10ml/g peptidyl resin)加入樹脂中，25 °C條件下，磁力攪拌2.5h后用砂芯漏斗將裂解液與樹脂分離，棄去樹脂，保留濾液。將濾液緩慢滴加到1eq體積的冰無水乙醚中，滴加完畢后，自然沉降30min。然后用高速離心機離心1min (4000rpm)，棄去上清液，保留沉淀，將所得沉淀在干燥箱中干燥8_10h，得到干粉粗品O
[0027]3:純化
[0028]取上述干粉粗品lg，用0.1 %三氟乙酸/水溶解。經過濾后，上樣到C18制備柱，用高效液相進行梯度洗脫，收集目標肽的洗脫液體，檢測液體純度。把合格的樣品混合后旋蒸，最后用凍干機凍干，得到Arg-Trp-Arg-Asn-Met，純度大于98%。
[0029]序列為:Arg-Trp-Arg-Asn-Met
[0030]質譜圖中可以看出Arg-Trp-Arg-Asn-Met 分子量是 381.7*2-2 = 761.4
[0031]紫外光譜圖中273nm處有肽的吸收峰。
【主權項】
1.一種與整合素α νβ 3具有高親和力的多肽，其序列為:Arg-Trp-Arg-Asn-Met。
2.權利要求1的多肽用于診斷腫瘤疾病的用途。
3.權利要求1的多肽用于治療腫瘤疾病的用途。
【專利摘要】本發明屬于生物工程制藥技術領域或蛋白質多肽類藥物及生物醫學工程領域，具體涉及一種對整合素受體具有高親和力的多肽及其應用，例如用于癌癥診斷和治療中。本發明所述的多肽由5個氨基酸組成其序列為精氨酸-色氨酸-精氨酸-天冬酰胺-蛋氨酸(Arg-Trp-Arg-Asn-Met)。體外流式細胞術測定親和力實驗表明本發明的多肽對整合素受體高表達的細胞有很強的靶向性；體外激光共聚焦細胞攝取實驗表明本發明的多肽能夠靶向到整合素受體αvβ3高表達的腫瘤細胞上，而對整合素受體αvβ3低表達的腫瘤細胞和正常細胞基本無靶向作用。體外細胞毒性結果顯示本發明的5肽對細胞基本無毒性，在癌癥的診斷和治療中，有著很好的應用前景。
【IPC分類】A61K47-48, A61P35-00, C07K7-06, C12Q1-04
【公開號】CN104774247
【申請號】CN201510190462
【發明人】顧月清, 張聰穎, 趙夢路, 王茜, 田彩平, 劉雨溪
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月20日