生產環肽的方法
【專利說明】生產環肽的方法 發明領域
[0001] 本發明涉及通過借助于酰基轉移酶使環脂肽的酰基鏈脫酰基從而生產環肽化合 物或其鹽的方法。
[0002] 發明背景
[0003] 環肽或環狀肽是其中末端氨基和末端羧基形成內部肽鍵的多肽。一些環肽因它們 的有益藥物屬性而眾所周知。在自然界中，環肽的長度可從僅幾個氨基酸至數百個氨基酸。 環肽可以是天然存在的化合物，但也可以通過全合成獲得或者通過天然存在或被天然產生 的前體的合成或基因修飾來獲得。后一類被稱為半合成環肽。當環肽帶有一個或多個脂 質尾或酰基鏈時，這種環肽被稱為環脂肽（cycliclipop印tide)。具有抗生素活性的環脂 肽化合物例如達托霉素和安福霉素，環脂肽的一個極佳實例是棘白菌素（echinocandins) 類，它們是有效的抗真菌劑。棘白菌素是帶有N-連接的酰基脂質側鏈且分子量約為1200Da 的兩親性六肽。藥學上有用的棘白菌素的實例是環六肽阿尼芬凈（anidulafungin)、卡泊芬 凈（caspofungin)、西洛芬凈（cilofungin)和米卡芬凈（micafungin)，它們在治療真菌感 染（尤其是由Aspergillus,Blastomyces,Candida,Coccidioides和Histoplasma弓|起的 那些）中有用。阿尼芬凈（l-[(4R，5R)-4,5-二羥基-N2-[[4〃-(戊氧基）[1，1'：4'，1〃-三 聯苯]-4-基]羰基]-1^-鳥氨酸]棘白菌素抝、卡泊芬凈（1-[(41?，55)-5-[(2-氨乙基）氨 基]-N2- (10, 12-二甲基-1-氧代十四烷基）-4-羥基-L-鳥氨酸]-5- [ (3R) -3-羥基-L-鳥 氨酸]-紐莫康定8。）和米卡芬凈（1-[(41?，510-4,5-二羥基-吧-[4-[5-[4-(戊氧基）苯 基]-3-異惡唑基]苯甲酰基]-L-鳥氨酸]-4- [ (4S) -4-羥基-4- [4-羥基-3-(磺酰氧基） 苯基]-L-蘇氨酸]紐莫康定心）均為半合成環六肽，它們可衍生自天然存在的棘白菌素， 例如棘白菌素B、紐莫康定Ap紐莫康定4或FR901379。
[0004] 天然環脂肽通常由微生物產生。達托霉素由土壤細菌Streptomycesroseosporus 產生。安福霉素由Streptomycescanus產生。天然棘白菌素（例如棘白菌素B,棘白菌素 C，阿枯菌素Ay，紐莫康定B。和FR901379)也通常由多種微生物產生。例如，棘白菌素B 由真菌Aspergillusnidulans產生，FR901379 由真菌Coleophomaempetri產生。
[0005] 環脂肽的酰基鏈已被證明是抗真菌活性和毒性的重要決定因素（Debono M.&GordeeR.S. ,Annu.Rev.Microbiol. 48, 471 (1994))。例如，天然存在的環狀抗真 菌脂肽FR901379帶有附接在N-末端的脂肪酸酰基基團，它展示出有效的體內抗真 菌活性(Iwamoto,T. ,FujieA. ,Nitta,K. ,Hashimoto,S. ,Okuhara,M. ,Kohsaka,M. ,J. Antibiot.￡L1092(1994))。不幸的是，就像一些其它天然存在的棘白菌素一樣，FR901379 也顯示出高溶血活性。酶法移除脂肪酸鏈并替換為辛氧基苯甲酰基酰基鏈顯示：FR901379 的原始活性被保留，但溶血活性顯著降低。另一個實例是米卡芬凈，其是通過將FR901379 的脂質尾交換成復雜的3, 5-二苯基取代異惡挫酰基基團產生的（Fujie,PureAppl. Chem.I2,4期，603-614頁（2007))。因此，環脂肽的天然酰基鏈的脫酰基允許引入替換性 側鏈，這改善抗真菌效力和降低溶血活性。
[0006] 借助于源自Actinoplanesutahensis的阿枯菌素A酰基轉移酶，環脂肽（例如棘 白菌素）的脫酰基已被建立。JP4228072(A)公開了催化脂質環肽代謝產物（例如棘白菌素B和阿枯菌素）的脂質酰基部分的脫酰基的酶。JP4075585描述了可在Streptomyces(作 為宿主生物體）中培養這種酰基轉移酶。從培養溶液中收集阿枯菌素A酰基轉移酶之后， 其被直接用于使底物脫酰基。在優化酶法脫酰基的過程中，已發現Streptomycesspp.的 一些酰基轉移酶更為有效。EP0885957A1描述了源自Streptomyces屬的環脂肽酰基轉移 酶，其能夠使環脂肽化合物（例如上述棘白菌素FR901379或其類似物）的酰基鏈脫酰基； 以及描述了生產環肽化合物的方法，所述方法包括使用所述酰基轉移酶。
[0007] 上述用于環脂肽的脫酰基的方法的缺點為：不能在工業上優選的生產宿主（例 如Escherichiacoli或Bacillus)中以有功能的形式和以足量產生上述酰基轉移酶。 在Streptomyces或Actinoplanesutahensis中生產酰基轉移酶在工業設定中不是優選 的，這是因為由于這些生物體中的低表達水平而導致相對較低的酶產量并且這些生物體 較不適用于發酵器系統。例如，在發酵器系統中使用Streptomyceslividans常常導致 粘度方面的問題，這阻止高細胞密度的獲得。此外，當在Streptomyces或Actinoplanes utahensis中生產上述酰基轉移酶時，存在下游處理方面的問題。在這些生物體中，酶似 乎附接于生物質，在酰基轉移酶的純化過程中，利用高鹽濃度萃取是必需的（EP0885957 Al,Kreuzman等人，2000,JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology, 24, 173 -180,Ueda等人，2011,JournalofBioscienceandBioengineering112, 409-414Ueda 等人，2011,JournalofAntibiotics紐,169-175)。考慮到腐蝕和環境問題，在大規模工 業生產中使用鹽從培養液中釋放酶是不期望的。
[0008] 考慮到嚴格管理和健康相關的要求，存在對經改進的純化和分離方法的需求。因 此，本發明旨在通過提供應用以下酰基轉移酶的方法在工業規模上改善環脂肽的脫酰基， 所述酰基轉移酶能夠在工業上優選的生產宿主中以有功能的形式被生產。
[0009] 發明詳沐
[0010] 本發明涉及生產環肽化合物或其鹽的方法，所述方法包括：使環脂肽化合物或其 鹽與來源于屬于Pseudomonas屬的微生物的酰基轉移酶接觸，以使所述環脂肽的脂質酰基 部分脫酰基。通過在從環脂肽生產環肽的方法中使用Pseudomonas酰基轉移酶，可以以更 高效的方式從環脂肽生產環肽，因為Pseudomonas酰基轉移酶能夠在工業上優選的生產生 物體中以高效和大規模的方式被生產。因此，本發明提供抗菌環肽的生產過程的重要改善。
[0011] 脫酰基之后，獲得的環肽可經受下述額外步驟：再酰化所述環肽以產生再酰化的 環肽。以這種方式，可以獲得期望的抗菌產物。再酰化環肽通常涉及合成環肽的新酰基鏈 的過程，隨后是將所述酰基鏈與環肽的游離氨基連接的過程。再酰化之后，可進一步處理再 酰化的環肽的酰基鏈以產生進一步處理的再酰化的環肽。這可通過任何合適的化學、半化 學或酶法方法實現。再酰化過程之后通常是純化由此得到的新環脂肽至合適的質量和/或 晶體形式。
[0012] 合成新酰基鏈的方法可以是本領域技術人員已知的任何方法，例如全化學合成或 半合成，即發酵之后一次或多次化學轉化。再酰化環肽的方法的一個實例可以是從1-溴辛 烷和4-羥基苯甲酸化學合成酰基鏈，隨后將由此得到的2, 4, 5-三氯苯基4-(正辛氧基） 苯甲酸酯與FR901379的脫酰基衍生物的游離氨基連接，如Fujie，PureAppl.Chem.迫，4 期，603-614頁（2007)中所述。
[0013] 根據本發明的生產環脂肽的方法可例如產生米卡芬凈或其鹽。因此，上述再酰化 的環肽或進一步處理的再酰化的環肽可以是米卡芬凈或其鹽。生產米卡芬凈的方法起始于 FR901379的生產。這可以通過下述實現：通過Coleophomaempetri發酵，隨后進行下游 處理以獲得FR901379或其鹽的所需純度。
[0014] 為了獲得米卡芬凈，首先必須移除FR901379的酰基側鏈。為了這個目的，實現在 工業上優選的生產菌株中表達源自Pseudomonas的酰基轉移酶，隨后進行下游處理和酶的 配制。然后進行生物催化過程，在這個過程中，FR901379的酰基側鏈被移除從而產生米卡 芬凈前體。
[0015] 為了從米卡芬凈前體合成米卡芬凈，首先必須有可用的恰當側鏈。對于米卡芬凈， 所述側鏈為3, 5-二苯基-取代異惡唑。可使用本領域技術人員已知的技術合成側鏈。隨 后，通過常規化學、半化學或酶法方法將側鏈與米卡芬凈前體連接。任選地進一步處理新酰 基鏈之后，純化米卡芬凈以獲得合適的質量和晶體形式。本領域技術人員可已知的用于將 期望的環肽純化至合適的質量和/或晶體形式的任意合適方法均可被應用。
[0016] 環脂肽
[0017] 環脂肽化合物可以是環脂肽例如達托霉素或安福霉素或其衍生物，或者棘白菌素 類的環脂肽。優選地，環脂肽是棘白菌素衍生物。棘白菌素是通式（1)的化合物，
【主權項】
1. 生產環肽化合物或其鹽的方法，所述方法包括：使環脂肽化合物或其鹽與來源于屬 于Pseudomonas屬的微生物的酰基轉移酶接觸，以使所述環脂肽脫酰基。
2. 根據權利要求1的方法，其包括再酰化所述環肽產生再酰化環肽的額外步驟。
3. 根據權利要求2的方法，其中進一步處理所述再酰化環肽的酰基鏈，產生進一步處 理的再酰化環肽。
4. 根據權利要求1-3中任一項的方法，其中所述酰基轉移酶獲自被編碼來源于 Pseudomonas的酰基轉移酶的載體轉化的生物體。
5. 根據權利要求4的方法，其中所述生物體選自由Escherichia coli,Bacillus, Pseudomonas alcaligenes, Pichia pastoris和Kluyveromyces Iactis組 成的組。
6. 根據權利要求4或5的方法，其中由所述載體編碼的酰基轉移酶是具有SEQIDN0:1 所示氨基酸序列或與SEQIDN0:1所示氨基酸序列有50-100%范圍內的序列同一性的氨基 酸序列的蛋白質。
7. 根據權利要求6的方法，其中所述蛋白質的氨基酸序列含有下列序列基序： i) D-X4-[V 或 T]-X2-L-[L 或 M]-X3-G(SEQ ID N0:3); ii)[L或 I]-P-G-L-P-X2-N(SEQ ID N0:4); iii) R-V-L-X2-W(SEQIDNO:5);和 iv)H-T-V-D-X3-H(SEQIDNO:6)， 其中乂"是長度為"n"的未指明氨基酸殘基的序列。
8. 根據權利要求4-7中任一項的方法，其中所述載體編碼SEQIDNO: 1所示的氨基酸 序列。
9. 根據權利要求1-8中任一項的方法，其中所述酰基轉移酶來源于Pseudomonas aeruginosa〇
10. 根據權利要求1-9中任一項的方法，其中所述環脂肽是棘白菌素衍生物。
11. 根據權利要求10的方法，其中所述棘白菌素衍生物選自由阿枯菌素A， cryptocandin，棘白菌素B，FR209602，FR901379,紐莫康定A、B和C以及孢利芬凈組成的 組。
12. 根據權利要求2-11中任一項的方法，其中所述再酰化環肽或所述進一步處理的再 酰化環肽是米卡芬凈或其鹽。
【專利摘要】本發明涉及生產環肽化合物或其鹽的方法，所述方法包括：使環脂肽化合物或其鹽與來源于屬于Pseudomonas屬的微生物的酰基轉移酶接觸，以使所述環脂肽的脂質酰基部分脫酰基。
【IPC分類】C12P21-02, C07K1-12, C07K7-50, C12N9-52
【公開號】CN104768966
【申請號】CN201380049118
【發明人】簡·米特斯卡·拉恩·范·德, 理查德·克爾曼, 魯道夫·吉斯波特斯·瑪麗·路易坦, 馬可·亞歷山大·伯格·范·丹
【申請人】中化帝斯曼制藥有限公司荷蘭公司
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2013年9月20日
【公告號】EP2897971A1, US20150218221, WO2014044803A1