一種天麻素的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥或食品技術領域，具體涉及一種共生發酵法生產天麻素的方法。
【背景技術】
[0002] 天麻，又名赤箭、獨搖芝等，是蘭科天麻屬多年生草本植物。根狀莖肥厚，無綠葉， 蒴果倒卵狀橢圓形，常以塊莖或種子繁殖。其根莖入藥用以治療頭暈目眩、肢體麻木、小兒 驚風等癥，是名貴中藥。
[0003] 天麻的有效成分之一為天麻素，天麻素有鎮靜、抗驚厥、抗炎及增強機體免疫功能 等作用。臨床上廣泛用于眩暈（美尼爾氏病、病毒性眩暈、神經痛等）、頭痛（神經衰弱及 神經衰弱綜合癥、血管性頭痛、緊張性頭痛、腦外傷綜合癥、偏頭痛等，以及癲癇的輔助治療 等。
[0004] 目前天麻素的工藝化生產中，主要是兩種：一類是從天麻中提取得到，一類是化學 合成得到；天麻素在天麻中含量只有〇. 1%，因此，從天麻中提取得到的方法，浪費了大量 的原藥材，并且還耗費時間、能量和提取劑等，天麻素的產品在臨床用量越來越大，提取效 率的提高也無法滿足（天麻素在天麻含量低的原因，因此，從天麻提取得到天麻素的方法 已經無法滿足市場需要；化學合成方法雖然能夠滿足產品的大量生產，但化學合成方法得 到天麻素因其安全性和環境污染等潛在風險，被研宄者和消費者關注。因此，研宄開發新的 制備方法獲得天麻素，具有重要理論價值和實際科學意義。
【發明內容】
[0005] 基于上述原因，本發明人在多年研宄的基礎上，得到一種新的天麻素的方法，該方 法采用將富產天麻素天麻內生菌和富產天麻素蜜環菌菌株接種于共生發酵培養基中發酵， 再從發酵產物中提取得到天麻素，該方法工藝簡單，適合工業化生產，不會造成資源浪費以 及環境污染，以本發明制備方法得當的天麻素為原料，制備成注射液具有更好的穩定性。
[0006] 本發明通過下述技術方案實現的。
[0007] 一種天麻素的制備方法，該方法為：將富產天麻素天麻內生菌和富產天麻素蜜環 菌菌株接種于共生發酵培養基中發酵，再從發酵產物中提取得到天麻素。
[0008] 其中富產天麻素天麻內生菌的制備方法為：
[0009] 采集新鮮天麻的塊莖、花莖、花或果實，在無菌條件下，用75%酒精消毒，無菌水沖 洗，吸干多余水分，分別切成〇.3cm*0. 3cm左右的小段或用無菌研缽磨成漿狀，接種在查氏 培養基和PDA培養基上，在20-60°C恒溫培養1-10天，獲得天麻內生菌的微生物菌株，然后 用篩選培養基發酵實驗，采用高效液相色譜定性檢測發酵液中天麻素的含量，從中篩選出 富產天麻素天麻內生菌，備用；
[0010] 所述篩選培養基為：葡萄糖l-50g/L、酵母膏l-10g/L、蛋白胨l-10g/L、硫酸鎂 0? l-10g/L、磷酸二氫鉀 0? l-5g/L、蜜環菌汁 200-800ml/L。
[0011] 其中富產天麻素蜜環菌菌株的制備方法為：
[0012] 采集天麻生長點的菌材，將其在無菌條件下，用75%酒精消毒，無菌水沖洗，吸干 多余水分后分別切成0. 3cm*0. 3cm左右的小段或用無菌研缽磨成漿狀，分別接種在查氏培 養基和PDA培養基上，在20-30°C恒溫培養1-10天，長出微生物，用篩選培養基發酵實驗， 利用高效液相色譜定性定量檢測發酵液中天麻素的含量，從中篩選出富產天麻素蜜環菌菌 株，備用；
[0013] 所述篩選培養基為：葡萄糖l-50g/L、酵母膏l-10g/L、蛋白胨l-10g/L、硫酸鎂 0? l-10g/L、磷酸二氫鉀 0? l-5g/L、榛葉汁 200-800ml/L。
[0014] 其中天麻素的制備方法為：
[0015] (1)將富產天麻素蜜環菌菌株按照5-20%的體積比接種到共生發酵培養基中發 酵30-180小時后，再將富產天麻素天麻內生菌按照5-20%的體積比接入共生培養基中于 溫度為20-70°C、攪拌轉速為10-600轉/分鐘條件下發酵1-20天；所述共生發酵培養基 為：蔗糖l〇-l〇〇g/L、麩皮浸出汁10_200ml/L、硫胺素0? l-50g/L、乙醇l-50g/L、磷酸二氫 鉀0. l-10g/L、基質10-900ml/L ;所述的基質為榛葉汁、榛樹疏松愈傷組織漿、榛樹內生菌 發酵液、板栗葉汁、櫟皮汁中的一種；
[0016] (2)將發酵好的共生發酵液加入1-10%重量比復合酶于40°C -55°c下酶解20-60 小時，將酶解后的共生發酵液濃縮，得到發酵天麻浸膏；所述的復合酶為重量比為1 : 1的 纖維素酶和淀粉酶；
[0017] (3)將發酵天麻浸膏與70%甲醇溶液按照體積比1 : 10-30比例混勻，浸提 30-90min，然后在功率400W溫度50-70°C條件下，微波提取10_50min，過濾，濃縮，干燥，得 天麻素。
[0018] 本發明所述采集天麻生長點的菌材是指天麻生長處于其共生的菌材。
[0019] 試驗例
[0020] 穩定性試驗：取實施例1、實施例3、實施例5的天麻素，制備成注射液，制劑制備工 藝為：取天麻素l〇〇g，加注射用水至lOOOrnl，溶解完全，0. 22 ym濾芯過濾，灌裝，121 °C滅菌 15分鐘，包裝，得到注射液1000支。取每個實施例樣品30支，按《藥物穩定性指導原則》進 行長期穩定性試驗，分別于〇、1、2、3月取樣考察樣品中天麻素含量及有關物質含量，試驗 結果見表1。
[0021] 制劑天麻素含量測定方法：
[0022] 照高效液相色譜法（中國藥典2010年版二部附錄V D)測定
[0023] 色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈_0. 1% 磷酸水（3 : 97)為流動相；檢測波長為220nm。取天麻素與雜質I各適量，加水溶解并稀 釋制成每lml中含天麻素與雜質I分別約為50 y g的溶液，作為系統適用性溶液。取10 y 1 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，理論板數按天麻素峰計算不低于5000,天麻素峰與雜質I峰 的分離度應大于10。
[0024] 測定法精密量取本品適量，用水定量稀釋制成每1ml中含50 yg的溶液，搖勻，精 密量取10 y 1注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取天麻素對照品適量，同法測定。按外標法 以峰面積計算，即得。
[0025] 雜質I :4-(3,4,5_三羥基-6-羥甲基）-四氫-2H-吡喃-2-基氧基苯甲醛， C13H160 7,分子量 284. 36
[0026] 有關物質：取本品適量，加水稀釋制成每1ml中含0. 5mg的溶液，作為供試品溶液； 精密量取lml，置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。照含量測定項下的 色譜條件，取對照溶液10 U 1注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約 為滿量程的30% ;再精密量取供試品溶液與對照溶液各10 y 1，分別注入液相色譜儀，記錄 色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。供試品溶液的色譜圖中如有雜質峰，單個雜質峰面積 不得大于對照溶液主峰面積的0. 5倍（0,5% )，各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰 面積（1. 0% )。
[0027] 表1不同實施例天麻素注射液穩定性比較試驗結果
【主權項】
1. 一種天麻素的制備方法，其特征在于：該方法為：將富產天麻素天麻內生菌和富產 天麻素蜜環菌菌株接種于共生發酵培養基中發酵，再從發酵產物中提取得到天麻素。
2. 根據權利要求1所述的一種天麻素的制備方法，其中富產天麻素天麻內生菌的制備 方法為： 采集新鮮天麻的塊莖、花莖、花或果實，在無菌條件下，用75 %酒精消毒，無菌水沖洗， 吸干多余水分，分別切成〇. 3cm*0. 3cm左右的小段或用無菌研缽磨成漿狀，接種在查氏培 養基和PDA培養基上，在20-60°C恒溫培養1-10天，獲得天麻內生菌的微生物菌株，然后用 篩選培養基發酵實驗，采用高效液相色譜定性檢測發酵液中天麻素的含量，從中篩選出富 產天麻素天麻內生菌，備用； 所述篩選培養基為：葡萄糖l-50g/L、酵母膏l-10g/L、蛋白胨l-10g/L、硫酸鎂 0?l-10g/L、磷酸二氫鉀 0?l-5g/L、蜜環菌汁 200-800ml/L。
3. 根據權利要求1所述的一種天麻素的制備方法，其中富產天麻素蜜環菌菌株的制備 方法為： 采集天麻生長點的菌材，將其在無菌條件下，用75%酒精消毒，無菌水沖洗，吸干多余 水分后分別切成〇. 3cm*0. 3cm左右的小段或用無菌研缽磨成漿狀，分別接種在查氏培養基 和PDA培養基上，在20-30 °C恒溫培養1-10天，長出微生物，用篩選培養基發酵實驗，利用高 效液相色譜定性定量檢測發酵液中天麻素的含量，從中篩選出富產天麻素蜜環菌菌株，備 用； 所述篩選培養基為：葡萄糖l-50g/L、酵母膏l-10g/L、蛋白胨l-10g/L、硫酸鎂 0?l-10g/L、磷酸二氫鉀 0?l-5g/L、榛葉汁 200-800ml/L。
4. 根據權利要求1所述的一種天麻素的制備方法，其中天麻素的制備方法為： (1) 將富產天麻素蜜環菌菌株按照5-20%的體積比接種到共生發酵培養基中發酵 30-180小時后，再將富產天麻素天麻內生菌按照5-20%的體積比接入共生培養基中于溫 度為20-70°C、攪拌轉速為10-600轉/分鐘條件下發酵1-20天；所述共生發酵培養基為： 蔗糖10-100g/L、麩皮浸出汁10-200ml/L、硫胺素0?l-50g/L、乙醇l-50g/L、磷酸二氫鉀 0.l-10g/L、基質10-900ml/L;所述的基質為榛葉汁、榛樹疏松愈傷組織漿、榛樹內生菌發 酵液、板栗葉汁、櫟皮汁中的一種； (2) 將發酵好的共生發酵液加入1-10 %重量比復合酶于40°C-55°C下酶解20-60小 時，將酶解后的共生發酵液濃縮，得到發酵天麻浸膏；所述的復合酶為重量比為I: 1的纖 維素酶和淀粉酶； ⑶將發酵天麻浸膏與70%甲醇溶液按照體積比1 : 10-30比例混勾，浸提30-90min， 然后在功率400W溫度50-70°C條件下，微波提取10_50min，過濾，濃縮，干燥，得天麻素。
【專利摘要】本發明屬于醫藥或食品技術領域，具體涉及一種天麻素的制備方法，該方法將富產天麻素天麻內生菌和富產天麻素蜜環菌菌株接種于共生發酵培養基中發酵，再從發酵產物中提取得到天麻素。該方法工藝簡單，適合工業化生產，不會造成資源浪費以及環境污染，以本發明制備方法得當的天麻素為原料，制備成注射液具有更好的穩定性。
【IPC分類】C12P19-44, C12R1-645
【公開號】CN104762348
【申請號】CN201510209113
【發明人】馮漾
【申請人】馮漾
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月29日