一種自內裂解大腸桿菌的裂解酶及其應用
【專利說明】
[0001]
技術領域
[0002] 本發明屬于微生物領域，具體涉及一種自內裂解大腸桿菌的裂解酶及其應用。
【背景技術】
[0003] 大腸桿菌是一類革蘭氏陰性細菌，因為其遺傳背景較為清楚，是分子生物學中常 用的模式菌株，也是工業上一類很重要的工程菌株。大腸桿菌是很多外源蛋白的生產菌株， 常被用來誘導生產各種蛋白質，如熒光蛋白（EGFP)，琥珀酸、Harpin蛋白，干擾素等。為了 獲得大腸桿菌胞內表達的外源重組蛋白，通常需要離心收集宿主菌體，然后用超聲波破碎， 或者壓力破碎。這需要大型的儀器設備，同時也消耗大量的能源。因此，尋找和開發一種溫 和的大腸桿菌自裂解的方法具有非常重要的意義。
[0004] 噬菌體裂解酶是雙鏈DNA噬菌體感染宿主細菌后晚期表達的一種細胞壁水解酶。 裂解酶大小通常為25 kD~40 kD，在結構上由兩個獨立的功能域構成，N-端的催化功能域， 和一個決定細胞結合位點的C-端細胞結合功能域（CBD)，二者之間由一個小片段鏈接。序 列分析表明，同一類裂解酶的催化域高度保守，而細胞結合域可變，這為構建新的嵌合裂解 酶提供了可能。裂解酶具有很高的特異性，只能特異性的識別和裂解特定種類的細菌。此 外，裂解酶作用位點很保守，加上噬菌體與細菌共同進化的特異性，宿主菌很難對其產生抗 性。到目前為止，已有一些能在體外裂解大腸桿菌的天然裂解酶被報道，這些酶可以直接或 者在膜透化劑(如EDTA)的輔助下自外裂解大腸桿菌，在體內表達時無法實現大腸桿菌的可 控自裂解。目前尚沒有利用裂解酶實現大腸桿菌可控自裂解后用于外源蛋白生產的報道。 因此，尋找能在大腸桿菌中穩定、可控的表達，且表達后能高效裂解大腸桿菌的裂解酶具有 非常重要的意義。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一種能在大腸桿菌種可控表達，且表達后能導 致大腸桿菌自裂解的裂解酶，為了敘述方便，我們命名為ClyN，其編碼基因C/jW。
[0006] 本發明提供的自內裂解大腸桿菌的裂解酶的編碼基因韻核酸序列如序列表 中 SEQ. ID. NO. 1 所示。
[0007] 本發明提供的自內裂解大腸桿菌的裂解酶ClyN的蛋白序列如序列表中SEQ. ID. NO. 2 所示。
[0008] 本發明還公開了一種將ClyN用于外源蛋白生產的方法。具體方法是： 將外源蛋白克隆至PBAD24表達載體，將ClyN克隆至pET28a ( + )表達載體，然后將兩 個質粒共轉大腸桿菌BL21(DE3); 先將轉化后的菌株培養在含有L-阿拉伯糖的培養基中誘導外源蛋白的表達，然后加 入IPTG誘導ClyN的表達，ClyN的表達會導致大腸桿菌的自裂解，釋放出胞內所表達的外 源蛋白。
[0009] 所述的外源蛋白為任何能在大腸桿菌中表達的蛋白質，如熒光蛋白（EGFP)，琥珀 酸、Harpin蛋白，干擾素等。
[0010] 本發明有以下的突出效果和優點： ClyN能在大腸桿菌中穩定、可控的表達，且表達后能導致大腸桿菌的高效自裂解，釋放 出胞內所表達的外源蛋白，具有溫和，高效、方便、無污染、低能耗等特點，可用于大腸桿菌 中外源蛋白表達后釋放。
[0011] 下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明。
【附圖說明】
[0012] 圖1為基因PCR擴增結果。圖中M為標準分子量marker。N為擴增勺 條帶。
[0013] 圖2為ClyN誘導大腸桿菌自裂解后0D_的變化結果。實心方塊所示為 BL21 (DE3)/pET28a( + )在IPTG誘導后0D6QQ隨時間的變化趨勢，空心三角所示為BL21 (DE3) / pET-ClyN在IPTG誘導后0D_隨時間的變化趨勢。
[0014] 圖3為ClyN誘導大腸桿菌自裂解后培養基中ATP的變化結果。縱坐標表示用熒 光素酶試劑盒測試的培養基中的發光強度。
[0015] 圖4為ClyN誘導大腸桿菌自裂解效率的結果。將大腸桿菌BL21(DE3)/pET-ClyN 加入IPTG后稀釋平板計數，用沒有加IPTG的組為對照。
[0016]圖5為ClyN誘導大腸桿菌自裂解后釋放胞內表達的EGFP效率的結果。將BL21 (DE3) /pET-ClyN/pBAD-EGFP菌株在含有L-阿拉伯糖的培養基中過夜培養后，加入0. 5 mM的IPTG誘導不同的時間，觀測培養液中的熒光強度，并與直接超聲破碎相比較。
[0017] 圖6為ClyN誘導大腸桿菌自裂解過程的結果。將BL21 (DE3) /pET-ClyN/pBAD-EGFP 菌株在含有L-阿拉伯糖的培養基中過夜培養后，與1mM的IPTG混合，用熒光顯微鏡監測 菌體的變化。
【具體實施方式】
[0018] 本發明設計和人工合成一種新的嵌合裂解酶ClyN。下列實施例中所用的方法如無 特別說明均是常規的實驗方法。實驗中所用到的引物均由上海英駿公司提供。測序均在上 海英駿公司完成。
[0019] 實施例1、能誘導大腸桿菌自裂解的裂解酶的構建 (1)在南京金斯瑞生物科技有限公司全序列合成能表達裂解酶ClyN的基因DNA 序列。合成序列裝入PUC57質粒中。以基因為模板，在目的基因的兩端分別加入Ncol 和Xhol的酶切位點，引物設計如下： 正向引物：5- ATATCCATGGGCATGCCTCCATCATTACG -3 (SEQ. ID. NO. 3) Ncol 反向引物：5- TATACTCGAGGTAGTTCAGGGTCTGGCCTG -3 (SEQ. ID. NO. 4) Xhol 以2 yl基因為模板，各加入引物1 yg進行PCR擴增，PCR擴增程序如下：1)94°C， 5 min ;2) 94 °C，30 sec，62 °C，45 sec，72 °C，45 sec，30 個循環；3)72 °C，10 min;將產 物進行凝膠電泳回收，電泳圖譜如圖韻基因大小為861 bp，與所設計的裂解酶的大 小一致。
[0020] (2)將基因連入表達質粒pET28a(+)中得到重組載體pET-ClyN，然后將其轉 化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得大腸桿菌工程菌株BL21 (DE3) /pET-ClyN。
[0021] 實施例2、ClyN誘導大腸桿菌自裂解的驗證 將大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-ClyN培養至0D6QQ=0. 8左右，加入IPTG至0? 5 mM后用酶 標儀監測菌液在600 nm吸收值的變化。同時，用沒有加IPTG的菌液作為負對照。最后得 到的裂解曲線見附圖2。結果顯示ClyN能誘導宿主菌株的快速自裂解從而導致在600 nm 吸收值快速降低。
[0022] 實施例3、ClyN誘導大腸桿菌自裂解后培養基中ATP的變化結果的驗證 將大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-ClyN培養至0D6QQ=0. 8左右，加入IPTG至0? 5 mM后，用熒 光素酶檢測試劑盒檢測菌液中發光值的變化。同時，用沒有加IPTG的菌液作為負對照。試 驗得到的發光曲線見附圖3。結果顯示ClyN誘導宿主大腸桿菌自裂解后能在培養液中檢測 到大量的ATP。
[0023] 實施例4、ClyN誘導大腸桿菌自裂解效率的結果的驗證 將大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-ClyN培養至0D6QQ=0. 8左右，加入IPTG至0? 5 mM后稀釋 平板計數，用沒有加IPTG的稀釋液作為負對照，所得到的結果見附圖4。結果顯示ClyN能 高效的誘導宿主大腸桿菌的自裂解，其裂解效率為99. 8%。
[0024] 實施例5、ClyN誘導大腸桿菌自裂解后釋放胞內表達的EGFP效率的結果的驗證。
[0025] 以EGFP作為外源蛋白的代表，將EGFP基因克隆至表達質粒pBAD24中得到 pBAD-EGFP質粒，將該質粒轉入大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-ClyN中得到EGFP工程菌株 BL21 (DE3) /pET-ClyN/pBAD-EGFP。將菌株 BL21 (DE3) /pET-ClyN/pBAD-EGFP 過夜培養在含 有0. 2% L-阿拉伯糖的LB液體培養基中，誘導EGFP基因的表達。次日，將菌體重懸至新鮮 LB中。取等體積的該菌液數份(每份100 ml)，分別加入0. 5 mM的IPTG后繼續培養0. 5， 1，2 h。培養結束后測定培養液上清中的熒光強度。為了方便比較，實驗中設立兩個對照， 一個為重懸后培養液中的熒光強度（即培養0 h時的熒光強度，此為空白對照)。另一份重 懸后直接超聲破碎(超聲3 s，停5 s，共超聲處理30 min)，測定上清中的熒光強度(此為陽 性對照)。通過比較培養液上清中的熒光強度來衡量ClyN誘導自裂解效率與傳統的超聲破 碎效率。試驗得到的鑒定結果見附圖5。結果顯示ClyN能高效的誘導EGFP的釋放，其釋放 效率相當于超聲破碎效率的89%。
[0026] 實施例6、ClyN誘導大腸桿菌自裂解過程的結果的驗證 將用L-阿拉伯糖誘導過夜的BL21 (DE3)/pET-ClyN/pBAD-EGFP細菌收集后加IPTG至1 mM，然后將菌液滴在1% LB-瓊脂固體上，將LB-瓊脂固體切成小方塊，用高分辨率熒光顯微 鏡對細菌的狀態進行實時監測，觀察細菌裂解的動態過程。試驗得到的鑒定結果見附圖6。 結果顯示ClyN能在誘導表達后15 min誘導宿主細菌的自裂解和胞內EGFP蛋白的釋放。
【主權項】
1. 一種自內裂解大腸桿菌的裂解酶ClyN，其蛋白序列如序列表中SEQ.ID.NO. 2所示。
2. 編碼權利要求1所述自內裂解大腸桿菌的裂解酶的基因C/j水其核酸序列如序列表 中SEQ.ID.NO. 1 所示。
3. 將權利要求1所述的裂解酶ClyN應用于大腸桿菌的自內裂解的方法，其特征在于， 將ClyN的基因導入大腸桿菌內，以表達的ClyN蛋白質作為自內裂解大腸桿菌的手段。
4. 將權利要求1所述的裂解酶ClyN用于外源蛋白生產的方法，其特征在于： 將外源蛋白克隆至PBAD24表達載體，將ClyN克隆至pET28a( + )表達載體，然后將兩 個質粒共轉大腸桿菌BL21(DE3); 先將轉化后的菌體培養在含有L-阿拉伯糖的培養基中誘導外源蛋白的表達，然后加 入IPTG誘導ClyN的表達，ClyN的表達會導致大腸桿菌的自裂解，釋放出胞內所表達的外 源蛋白。
5. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的外源蛋白為熒光蛋白、琥珀酸、 Harpin蛋白或干擾素。
【專利摘要】本發明公開了一種自內裂解大腸桿菌的裂解酶及其應用。本發明采用基因拼接的手段，構建了一個全新的裂解酶ClyN，該酶在大腸桿菌中表達后能導致宿主大腸桿菌的自裂解，釋放出胞內表達的ATP和蛋白質。重組蛋白ClyN表達質粒能很好的在大腸桿菌BL21(DE3)中復制，在IPTG的誘導下表達15 min后即可觀察到明顯的誘導大腸桿菌自裂解的現象，誘導裂解效率為99.8%。當宿主細菌中表達有異源增強型綠色熒光蛋白（EGFP）時，EGFP會在大腸桿菌裂解后釋放到溶液中，且其釋放效率是直接超聲破碎效率的89%。因此，ClyN能用于異源蛋白在大腸桿菌中表達后的提取與釋放，具有廣大的應用前景。
【IPC分類】C12N9-88, C12N15-60, C12N15-70
【公開號】CN104762285
【申請號】CN201510197003
【發明人】危宏平, 楊航, 余軍平
【申請人】武漢賽思銳微生物技術有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月23日