一株酵母菌及其在納米金合成中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，涉及一株酵母菌ingens LH-Fl及其在納米金合成中的應用。
【背景技術】
[0002]納米材料由于具有獨特的力學、熱學、聲學、光學、電磁學等性質，在傳感技術、信息儲存、光電催化、生物標記、藥物載體、臨床治療等領域中有著重要的潛在應用價值。納米金顆粒作為納米材料的一員，其合成與應用一直受到研宄者的廣泛關注。然而，傳統的物理、化學合成方法存在能耗高、成本高、需要使用有毒材料或試劑等問題。因此，開發綠色環保、經濟簡便的納米金合成方法已變得越來越重要。微生物法憑借環境友好、條件溫和、綠色低毒等優勢已逐漸成為納米金合成領域的研宄熱點。
[0003]目前已報道了多種微生物具有合成納米金的能力，包括細菌、真菌、放線菌、病毒等，它們可以在胞內或胞外等不同位點合成多種形貌的納米金顆粒，如球形、三角形、六邊形等。與其他微生物相比，真菌合成納米金具有顯著的優勢:真菌在流動壓力、震蕩等不良環境條件下具有較好的穩定性，能夠分泌豐富的胞外蛋白/酶用于催化納米金的合成，得到的納米顆粒分散性好，形貌多樣，下游工藝及分離方法簡單，具有工業化應用前景。目前報道的典型的納米金合成真菌有Aspergillus fumigatus、Penicillium、Rhizopusoryzae > Trichodertm viride、Trichothecium、Vertici 11 iurr^。
[0004]酵母菌，作為一種單細胞真菌，在納米材料的生物合成中也有著重要的應用，如量子點(MS、金屬氧化物T12等，然而在納米金合成中的報道相對較少。Gericke和Pinches研宄發現畢赤酵母菌Pichia j'at/iflii可以在胞內合成納米金，其尺寸小于100nm (HydrometalIurgy, 2006, 83: 132-140)。Agnihotri 等研宄發現熱帶海洋酵母菌Yarrowia Iipolytica NCIM 3589可以合成三角形、六邊形等形貌的納米金(MaterialsLetters, 2009, 63: 1231-1234)。本實驗室前期從大連黑石礁近海底泥中分離得到一株酵母菌Magnus1myces ingens LH-FI，其在好氧條件下對多種偶氮染料具有較好脫色能力，如酸性紅B、酸性紅3R、酸性橙II等(B1resource Technology, 2014, 158:321-328)。然而，目前尚未有研宄報道利用酵母菌進行納米金的合成。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一株具有納米金合成能力的酵母菌Magnus1mycesingens LH-FI,以及該菌株在還原HAuCl4合成納米金顆粒中的應用。
[0006]本發明涉及的酵母菌ingens LH-Fl為前期從大連近海底泥中篩選得到，具有多種偶氮染料好氧脫色的能力。該菌株于2015年I月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.10367。保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研宄所。
[0007]菌株LH-Fl在固體培養基中呈乳白色，表面皺褶，邊緣不規則，易挑起；菌株在含有 KH2PO4 I g/L，MgS047H20 0.5 g/L，(NH4)2SO4 I g/L，葡萄糖 4 g/L 的培養基中，30°C，150r/min條件下培養32~36小時可生長至穩定期。
[0008]一株酵母菌ingens LH-Fl在納米金合成中的應用，包含以下步驟:
(1)將酵母菌ingens LH-F1 接種于含有 KH2PO4 I g/L，MgS047H20 0.5g/L, (NH4)2SO4 I g/L，葡萄糖4 g/L的培養基中，好氧培養28~32 h至對數期末期，離心收集菌體，用滅菌的超純水洗滌并制備菌懸液；
(2)在菌懸液中加入撤11(:14進行生物轉化反應制備納米金顆粒，納米金的制備條件為:菌懸液OD6J直為2.0-2.5，HAuCl 4濃度為0.5-2.0 mmol/L,反應溫度為30°C，搖床轉速為150 r/min，反應時間為16-20 h。
[0009]所述酵母菌焊ces ingens LH-Fl制備生成的納米金顆粒為三角形或六邊形，并以三角形為主。
[0010]本發明的有益效果:酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl于2015年I月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.10367。該菌株在30°C下可催化0.5~2.0 mmol/L HAuCl4^成以三角形片狀為主要形貌的納米金顆粒，反應16 h即可達到穩定。酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl為納米金材料的生物制備提供了一種新的微生物資源，該菌株合成納米金的反應條件溫和，操作簡單，反應時間短，成本低，具有潛在的工業化應用前景。
【附圖說明】
[0011]圖1 為酵母菌 Magnus1myces ingens LH-Fl 的生長曲線。
[0012]圖2為酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl合成納米金過程的紫外_可見光全波長掃描圖。
[0013]圖3為酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl利用不同濃度HAuCl4合成納米金的紫外-可見光全波長掃描圖。
[0014]圖4為酵母菌ingens LH-Fl合成的納米金的掃描電鏡圖。
[0015]圖5為酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl合成的納米金的透射電鏡圖。
【具體實施方式】
[0016]以下結合實施例對本發明作進一步說明。
[0017]實施例1:酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl生長曲線的測定
將酵母菌焊ces ingens LH-Fl按照體積百分比5%的接種量接入100 mL培養基中，在30°C，150 r/min條件下振蕩培養48 h，每隔4 h取樣米用紫外-可見分光光度計測量600 nm處的吸光度((?_值)。結果表明(圖1)，菌株LH-Fl生長較快，培養8 h后進入對數生長期，培養32~36 h后進入穩定生長期。
[0018]上述所用培養基的成分為:KH2PO4I g/L，MgS047H20 0.5 g/L，(NH4)2SO4 I g/L，葡萄糖4 g/L ο所用培養基均在115°C下滅菌15 min后使用。
[0019]實施例2:酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl合成納米金的應用步驟1:根據實施例1的方法，培養酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl至對數期末期，于10000 g下離心10 min，去除上清，收集菌體，用滅菌的超純水洗滌2次，并用超純水制備菌懸液，調節OD_值為2.0-2.5。
[0020]步驟2:取2 mL步驟I中制備的菌懸液于5 mL離心管中，加入HAuCl4使其終濃度為1.0 mmol/L，將培養液于150 r/min, 30°C搖床中振蕩孵育16~20 h，合成納米金顆粒。
[0021]在反應過程不同時間取樣，于3000 g下離心5 min，取上清液利用紫外-可見分光光度計進行全波長掃描。結果如圖2所示，在反應前8 h時，紫外-可見全波長掃描圖中沒有明顯的吸收峰；反應10 h后，在550 nm處出現了納米金顆粒的特征吸收峰，且隨著反應時間的延長，特征峰強度逐漸增加，反應16 h后基本趨于穩定。與之對應的實驗現象是，培養液顏色由最開始的淡黃色(HAuCl4的顏色)逐漸變為紫色(納米金顆粒的顏色)，并且紫色程度逐漸加深，在反應16 h后紫色程度基本一致，說明生成的納米金顆粒主要為紫色物質。
[0022]實施例3:酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl利用不同濃度的撤11(^14合成納米金
根據實施例2步驟I制備酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl菌懸液(00_為
2.0-2.5)，取2 mL菌懸液于5 mL離心管中，分別加入HAuCl4使其終濃度為0.1,0.5,1.0、
2.0和5.0 mmol/L，將培養液于150 r/min, 30°C搖床中振蕩孵育16~20 h，然后將培養液在3000 g下離心5 min，取上清液利用紫外-可見分光光度計進行全波長掃描。結果如圖3所示，當HAuCl4濃度為0.1 mmol/L時，紫外-可見全波長掃描圖中沒有明顯的吸收峰，生成的納米金含量很低；當HAuC14&度大于0.5 mmol/L時，紫外-可見全波長掃描圖中有明顯的納米金特征峰，且峰強度隨HAuCl4濃度的升高而增加；而當HAuCl 4濃度為5.0 mmol/L時，紫外-可見全波長掃描圖中沒有明顯的吸收峰，說明過高濃度的HAuCl4對納米金的合成具有一定的抑制作用。
[0023]實施例4:酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl合成納米金的掃描電鏡與透射電鏡表征
根據實施例2的方法制備的納米金顆粒，將得到的產物進行掃描電鏡與透射電鏡表征，結果如圖4和圖5所示。酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl催化HAuCl4^成的納米金顆粒大多呈現片狀形貌，包括三角形、六邊形等，其中以三角形為主；生成的納米片大小不一，粒徑尺度為50~400 nm。
【主權項】
1.一株酵母菌Magnus1myces ingens LH-Fl，其特征在于:所述菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.10367，保藏日期為2015年I月19日。
2.根據權利要求1所述的一株酵母菌Magnus1mycesingens LH-Fl在納米金合成中的應用，其特征在于包含以下步驟: (1)將酵母菌ingensLH-F1 接種于含有KH2PO4 I g/L，MgSO4.7Η20 0.5g/L，(NH4)2SO4 I g/L，葡萄糖4 g/L的培養基中，好氧培養28~32 h至對數期末期，離心收集菌體，用滅菌的超純水洗滌并制備菌懸液； (2)在菌懸液中加入撤11(:14進行生物轉化反應制備納米金顆粒，納米金的制備條件為:菌懸液OD6J直為2.0-2.5，HAuCl 4濃度為0.5-2.0 mmol/L,反應溫度為30°C，搖床轉速為150 r/min，反應時間為16-20 h。
3.根據權利要求2所述的一株酵母菌Magnus1mycesingens LH-Fl在納米金合成中的應用，其特征在于:所述酵母菌Magmis1myces ingens LH-Fl制備生成的納米金顆粒為三角形或六邊形。
【專利摘要】本發明公開一株酵母菌及其在納米金合成中的應用，屬于生物技術領域。該酵母菌為Magnusiomyces ingens LH-F1，于2015年1月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 10367。該菌株在30℃下可催化0.5~2.0 mmol/L HAuCl4合成以三角形片狀為主要形貌的納米金顆粒，反應16 h即可達到穩定。該菌株合成納米金反應條件溫和，操作簡單，反應時間短，成本低，具有潛在的工業化應用前景。CGMCC No. 1036720150119
【IPC分類】C12R1-645, C12P3-00, C12N1-16
【公開號】CN104762221
【申請號】CN201510180584
【發明人】曲媛媛, 張照婧, 張旭旺, 沈文麗, 李會杰, 厲舒幀, 馬橋, 周集體
【申請人】大連理工大學
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月17日