明亮發光桿菌凍干粉及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及明亮發光桿菌制劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 基于現階段我國環境污染狀況，發光菌毒性檢測法是高效便捷的測定污染物生物 毒性的有效手段。發光菌毒性檢測法的最大優勢是它可以現場檢測，方法快速、準確，操作 簡便。發光細菌的相對發光度和水體綜合毒性呈顯著負相關，利用光電檢測技術將對環境 敏感的發光細菌用于水體毒性的檢測具有簡單、快速的優點。在現場進行毒性檢測，要求操 作快速、簡單，而新鮮菌液不方便攜帶，在戶外也不易保存。因而更多的是使用凍干粉，只需 5分鐘的快速復蘇后即可使用，活性與靈敏度與新鮮菌液接近。然而，市場上銷售的凍干粉 價格貴，而且難以保證每批活性在同一水平。因此，許多科研機構開始自主研制凍干粉，既 能保證菌的穩定活性也能降低經費。而制備凍干粉的關鍵在于凍干前的菌懸液制備，其中 保護劑成分及配比影響最顯著。本研宄擬通過優化后的菌液制備凍干粉，克服傳統檢測方 法范圍小、結果不穩定等缺點，使得發光菌生物毒性檢測范圍更廣、結果重復性和準確性更 高，為進一步拓寬發光菌在線監測的實際應用打下基礎。
[0003]發光桿菌屬菌體多呈桿形，革蘭氏陰性菌，無孢子和莢膜，有鞭毛。最適生長溫度 一般為15-26°C，最適pH范圍一般為6.5~7. 5,超過25°C生長.將受到抑制，其.生長.基 質里需要一定的NaCl，起到維持滲透壓的作用。
[0004]目前，所述明亮發光桿菌是采用如下的方法保存的：
[0005]取一支發光細菌凍干粉，用砂輪將安瓿瓶切開一個小口，在超凈工作臺內，緩慢加 入lml冷藏過的3 % NaCl，輕微震蕩，復蘇lOmin后，用接種環接種至固體培養基中，20°C下 生長20~24小時，直置黑暗處可見藍綠色光。用接種環挑取一個較亮的單菌落，置于50ml 的液體培養基中，20°C振蕩培養18~20小時。
[0006]菌種保存：將菌液離心，除去上清液，重新懸浮于含有3% NaCl的滅菌甘油里 (20%甘油），分裝置EP管中，于-70°C保存。此保存方法保存時間較短，僅用于保存菌種， 無法直接進行毒性測試。
[0007] 微生物在進行凍干是一種較好的方法，一般需要有冷凍保護介質（例如簡單的 10%脫脂乳或是較復雜的動物血清）幫助菌體在低溫下存活。優質的冷凍保護劑至少具備 兩種功能：當細胞里的水分逐漸流失時，保護劑可以穩定細胞形態；維持干燥前后的樣品 形狀。
[0008]目前，常用的凍干保護劑有二糖，如海藻糖、BSA血清，脫脂乳，甘露醇等，但是，單 一的保護劑，難以獲得較好的效果，需要進行改進。
[0009] 保護劑的主要作用是在冷凍過程中，消除細胞內部凍結水之間的冰晶機械作用， 因為機械作用會破會細胞內部的化學鍵、細胞質膜。但由于各個保護劑的濃度、細胞滲透的 能力等等不盡相同，因而所起的冷凍保護作用會有差異。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的是提供一種明亮發光桿菌凍干粉及其制備方法，以克服現有技術存 在的缺陷。
[0011] 本發明所述的明亮發光桿菌凍干粉，包括如下重量百分比的組分：
【主權項】
1. 明亮發光桿菌凍干粉，其特征在于，包括如下重量百分比的組分：
2. 根據權利要求1所述的明亮發光桿菌凍干粉，其特征在于，包括如下重量百分比的 組分：
3. 根據權利要求1所述的明亮發光桿菌凍干粉，其特征在于，包括如下重量百分比的 組分：
4. 根據權利要求1~3任一項所述的明亮發光桿菌凍干粉，其特征在于，所述的菌體來 自于培養的明亮發光桿菌的菌液離心去上清后剩下的菌體。
5. 根據權利要求4所述的明亮發光桿菌凍干粉，其特征在于，菌體的制備方法如下：取 一支明亮發光桿菌（Photobacterium phosphoreum)EP管，將菌液接種到裝有50ml培養基 的250ml錐形瓶中，根據前期優化的培養條件，接種量為2%，200r/min，pH7. 0,18°C振蕩培 養 16-20h ; 所述培養基的配方： 酵母粉（Oxoid) 5. 0g，胰蛋白胨（Oxoid) 5. 0g，Na2HP045. 0g，KH2PO4L Og NaC130.0 g，甘油 3. Og，去離子水 1000ml ; 將培養好的菌液置于離心管中，7000~9000r/min下，優選8000r/min下，離心 20-30min，去除上清液，用重量濃度為3~10%的NaCl溶液洗滌、離心，去除上清液，收集沉 淀物，即為所述的菌體。
6.根據權利要求1~5任一項所述的明亮發光桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于，包 括如下步驟： (1) 所述的菌體加入脫脂乳、海藻糖、精氨酸和氯化鈉的混合物中，分散，然后置于安瓿 瓶中，-30~-20°C預冷1-2小時，再在-65~-75°C預凍8-12小時； (2) 將預凍后的安瓿瓶，放入真空冷凍干燥儀內，冷凍干燥至含水重量為3%以下，即 可獲得所述的明亮發光桿菌凍干粉。
【專利摘要】本發明公開了一種明亮發光桿菌凍干粉及其制備方法，所述明亮發光桿菌凍干粉，包括如下重量百分比的組分：脫脂乳25～35％，海藻糖20～24％，精氨酸0.7～1.0％，氯化鈉1～1.5％，菌體余量。本發明采用復合冷凍保護劑，試驗證明，其抗凍能力大大提高，具有比單一的保護劑更強的保護性能，且具有很好的穩定性。本發明獲得的明亮發光桿菌凍干粉，其發光度平均值為1843mv左右，接近模型預期值1820mv。并用制備的凍干粉對ZnSO4·7H2O、K2Cr2O7和C6H5OH的毒性進行檢測，發現不同批次間的凍干粉測得的EC50值變異系數均小于6％。
【IPC分類】C12N1-20, C12R1-01, C12N1-04
【公開號】CN104762209
【申請號】CN201510144197
【發明人】馮耀宇, 李佩, 蘇嘉緣, 孟芹, 胡越, 蔡敏
【申請人】華東理工大學
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年3月30日