相轉變分離純化溫敏性羥丁基殼聚糖的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種溫敏性羥丁基殼聚糖的分離純化方法，該方法適用于溫敏性羥丁基殼聚糖衍生物的基礎研究和大規模生產，該方法的使用擺脫了傳統的濃縮沉淀方法無法有效沉淀的弊端，使溫敏性羥丁基殼聚糖的大規模生產和質量控制成為可能。
【背景技術】
[0002]溫敏性殼聚糖是一類對外界溫度的變化刺激可以做出智能性響應的一類殼聚糖衍生物，其主要的特點是低溫下為流動的液體，而當溫度升高時，溫敏性羥丁基殼聚糖可以發生智能性的相轉變，轉化為不流動的凝膠；其發生相轉變的溫度被稱為最低臨界溶液溫度，該溫度可以從10-37°C不等，且該溫度可以調節。
[0003]溫敏性殼聚糖發生相轉變的機理主要是溶液體系中的各種物理作用力之間的動態平衡。即溫敏性殼聚糖溶液體系中之間存在親水-疏水、氫鍵以及范德華力等多種物理作用力，溶液體系中這三種作用力之間存在著一個動態平衡，共同維持著殼聚糖溶液體系的穩定，當溫度升高時，氫鍵作用力被破壞，親水-疏水作用占據主導地位，因而動態平衡被打破，溶液體系轉變為凝膠體系。
[0004]目前溫敏性殼聚糖主要包括羥丁基殼聚糖、殼聚糖-甘油磷酸鹽以及PEG-殼聚糖等，在國內也有諸多專利開展上述工作，其中研究的熱點為羥丁基殼聚糖，其主要原因是殼聚糖-甘油磷酸鹽體系的最低臨界溶液溫度過高，不適合體內的拓展應用，且溶液-凝膠過程不可回復。羥丁基殼聚糖作為一種新型的殼聚糖衍生物，最近得到了飛速的發展，“一種溫敏性殼聚糖衍生物-羥丁基殼聚糖的制備方法” (ZL200810033699.6)、“一種預防腦脊液漏的醫用級溫敏性羥丁基殼聚糖封閉劑的制備方法” (201110430139.6)等多項專利均涉及到羥丁基殼聚糖的制備及其應用。
[0005]羥丁基殼聚糖為一種兩親性高分子多糖，由于分子鏈中引入了親水性基團-羥丁基，其水溶性明顯改善，且乳化性能也得到了極大的改善。在羥丁基殼聚糖的產業轉化過程中，產品的安全性是最重要的控制指標之一，而傳統的工藝是對其進行分離純化去除產品中的有毒雜質，最常用的方法為酒精分級沉淀，而低濃度下的羥丁基殼聚糖在酒精的溶解度大大提高限制了該方法的應用，因而針對上述難題提供一套科學完整的分離純化方案是羥丁基殼聚糖產業轉化中首當其沖的問題。而在國內公開或授權的專利中并沒有出現專門針對溫敏性羥丁基殼聚糖及其衍生物純化的發明專利。
[0006]本發明專利為我們申請的有關羥丁基殼聚糖的系列專利之一，主要是為了解決產業轉化過程中的實際難題，加強產品的質量控制，提高產品的安全性。
【發明內容】
[0007]本發明是針對低濃度溫敏性羥丁基殼聚糖溶于酒精這一特殊現象，提供一套分離純化的工藝流程。
[0008]為了實現以上目的，本發明提供一種純化溫敏性羥丁基殼聚糖的方法具體步驟如下:
第一步:分別配制不同濃度梯度的NaCl溶液，即低、中、高濃度，待用；
第二步:將濃度為0.1-5% (m/v)的溫敏性羥丁基殼聚糖加入濃度為1-5%的NaCl溶液充分攪拌進行初級沉淀，；
第三步:將第二步得到的沉淀進行粉碎處理，然后放入濃度為10-15%的NaCl溶液中繼續攪拌，進行二級沉淀；
第四步:將第三步得到的沉淀轉入濃度為20-25%的NaCl溶液中繼續攪拌脫水進行三級沉淀，得到白色狀沉淀，然后結固液分離，得到粗品；
第五步:將得到的粗品通過有機溶劑的梯度洗脫去除NaCl，梯度分別為70%、80%、90%、100%得到粉狀去鹽沉淀；
第六步:粉狀去鹽沉淀40°C真空干燥去除有機溶劑和水分，得到溫敏性羥丁基殼聚糖精制干粉。
[0009]通過上述步驟，可以有效去除小分子片段及副產物雜質，提高溫敏性羥丁基殼聚糖的純度。
[0010]本發明的優點:
1.本發明提供的方法解決了溫敏性羥丁基殼聚糖低濃度溶液無法有機溶劑沉淀的難題
2.本發明提供的方法充分利用溫敏性羥丁基殼聚糖的相轉變機理，通過梯度NaCl溶液進行分級沉淀，達到了濃縮和純化的目的。
[0011]3.本發明提供的方法提高了溫敏性羥丁基殼聚糖的分子量并縮小了分子量的分布，達到了純化的效果。
[0012]說明書附圖
圖1純化后的溫敏性羥丁基殼聚糖FT-1R圖譜圖2未純化前的溫敏性羥丁基殼聚糖的分子量及其分子量分布圖3純化后的溫敏性羥丁基殼聚糖的分子量及其分子量分布。
【具體實施方式】
[0013]現結合實施例，對本發明作了詳細描述:
實施例一
分別配制濃度分別為2%、10%和20%的氯化鈉水溶液，以及2%的溫敏性羥丁基殼聚糖水溶液。先將2%的氯化鈉水溶液加入到攪拌狀態的溫敏性羥丁基殼聚糖水溶液500ml中，直到白色沉淀析出，濾去溶液后，加入10%的氯化鈉水溶液500ml，充分攪拌，濾去溶液后，再加入20%的氯化鈉水溶液500ml，充分攪拌，濾去溶液后，得到白色沉淀粗品。
[0014]將該沉淀依次用70%、80%、90%和100%的丙酮500ml洗滌除鹽，最終得到白色沉淀，該沉淀用40°C真空干燥后，得到溫敏性羥丁基殼聚糖精制純品7.4g。
[0015]實施例二
分別配制濃度分別為4%、15%和20%的氯化鈉水溶液，以及1%的溫敏性羥丁基殼聚糖水溶液。先將4%的氯化鈉水溶液加入到攪拌狀態的溫敏性羥丁基殼聚糖水溶液500ml中，直到白色沉淀析出，濾去溶液后，加入15%的氯化鈉水溶液500ml，充分攪拌，濾去溶液后，再加入20%的氯化鈉水溶液500ml，充分攪拌，濾去溶液后，得到白色沉淀粗品。
[0016]將該沉淀依次用70%、80%、90%和100%的丙酮500ml洗滌除鹽，最終得到白色沉淀，該沉淀用40°C真空干燥后，得到溫敏性羥丁基殼聚糖精制純品3.2g。
[0017]實施例三
分別配制濃度分別為5%、15%和25%的氯化鈉水溶液，以及0.5%的溫敏性羥丁基殼聚糖水溶液。先將5%的氯化鈉水溶液加入到攪拌狀態的溫敏性羥丁基殼聚糖水溶液500ml中，直到白色沉淀析出，濾去溶液后，加入15%的氯化鈉水溶液500ml，充分攪拌，濾去溶液后，再加入25%的氯化鈉水溶液500ml，充分攪拌，濾去溶液后，得到白色沉淀粗品。
[0018]將該沉淀依次用70%、80%、90%和100%的乙醇500ml洗滌除鹽，最終得到白色沉淀，該沉淀用40°C真空干燥，得到溫敏性羥丁基殼聚糖精制純品1.6g。
[0019]實施例四
取精制的溫敏性羥丁基殼聚糖純品，采用KBr壓片法進行FT-1R檢測，得到紅外譜圖(附圖1)，其特征峰可以較準確反應溫敏殼聚糖的特征基團，結果顯示該純化方法并沒有破壞溫敏性羥丁基殼聚糖的化學結構。
[0020]實施例五
取溫敏性羥丁基殼聚糖精品溶解在注射用水中得到濃度為0.8% (m/v)的溶液，然后進行分子量測定考察純化前后的分子量變化(附圖2，3)，結果表明經過純化后，分子量從51萬Da提高到71萬Da，且分子量的分散系數從1.6縮小至1.3。
【主權項】
1.相轉變分離純化溫敏性羥丁基殼聚糖的方法，主要利用相轉變進行分離純化，即溫敏性羥丁基殼聚糖隨著離子強度得增加會發生溶膠-凝膠的相轉變，其主要特征為利用不同濃度梯度的鹽溶液，將一定濃度的溫敏性羥丁基殼聚糖進行分級沉淀，然后利用不同濃度梯度的有機溶劑進行梯度洗脫，最后40°c真空干燥得到純化的溫敏性羥丁基殼聚糖干粉。
2.權利要求1中所述的不同濃度梯度的鹽溶液是指高、中、低三種不同濃度的鹽溶液，其濃度分別為20-25%、10-15%以及1-5% (m/v)。
3.權利要求2中的鹽溶液是指鈉鹽或鉀鹽，如NaCl、KCl、NaAC、KCUNa2SO4,K2SO4、等。
4.權利要求1中的一定濃度的溫敏性羥丁基殼聚糖是指控制分離純化前的制品濃度為 0.1-5% (m/v)。
5.權利要求1中的分級沉淀是指溫敏性羥丁基殼聚糖首先在低濃度的鹽溶液中進行初級沉淀，然后準入中濃度的鹽溶液中進行二級沉淀，最后放入高濃度的鹽溶液中進行三級沉淀。
6.權利要求1中所述的有機溶劑是指乙醇或丙酮。
7.權利要求1中所述的不同濃度梯度的有機溶劑是指其濃度梯度分別為100%、90%、80%和 70% (v/v)0
8.權利要求1中所述的梯度洗脫是分別采用權利要求7中的梯度有機溶劑從低到高依次進行洗脫除鹽。
【專利摘要】本發明提供了一種利用相轉變原理分離純化溫敏性羥丁基殼聚糖的方法，該方法主要利用溫敏性羥丁基殼聚糖隨著離子強度的增加會發生溶膠-凝膠的相轉變，基于上述機理，本發明利用用不同濃度梯度的鹽溶液，將一定濃度的溫敏性羥丁基殼聚糖進行分級沉淀，然后利用不同濃度梯度的有機溶劑進行梯度洗脫，最后40℃真空干燥得到純化的溫敏性羥丁基殼聚糖干粉。通過以上方法，對溫敏性羥丁基殼聚糖的化學結構不產生任何破話，同時有效地去溶液中雜質和小分子片段，提高了溫敏性羥丁基殼聚糖的分子量及其分子量分布，取得了理想的分離純化效果，最終解決了溫敏羥丁基殼聚糖無法通過濃縮沉淀純化的難題，使大規模生產和質量控制成為可能。
【IPC分類】C08B37-08
【公開號】CN104761657
【申請號】CN201410007429
【發明人】魏長征, 奚宏偉, 侯春林
【申請人】上海其勝生物制劑有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2014年1月8日