用于遞送生物活性材料的低分子量支化聚胺的制作方法
【專利說明】用于遞送生物活性材料的低分子量支化聚胺
[0001] 聯合研發協議的各方
[0002] 本發明是在 International Business Machines Corporation和 the Agency For Science，Technology and Research的聯合研發協議下做出的。
[0003] 背景
[0004] 本發明涉及用于遞送生物活性材料的低分子量支化聚胺，更具體地，涉及氨基甲 酸酯官能化的低分子量支化聚乙烯亞胺，其包含用于基因遞送的疏水氨基甲酸酯端基。
[0005] 基于核酸的療法在治療人類疾病上大有前景。理論上，不僅錯誤和缺陷基因可以 被功能基因修正和替換，而且多余的基因表達也可以通過使用RNA干預而被抑制到正常水 平。通常，有兩個主要類型的基因遞送載體，即病毒載體和非病毒載體。盡管病毒載體具有 優越的轉導能力，但是病毒載體的致免疫和致癌的可能性限制了其臨床應用。為了避免這 個問題，已經報道了一些非病毒基因遞送系統，其包括（1)核酸與包括脂類、聚合物和肽在 內的多種陽離子分子的復合以及（2)核酸與諸如膽固醇和細胞穿透肽的天然配體的結合。 非病毒基因遞送載體正在受到更多的關注，這是由于其生物安全性、低生產成本、運輸和儲 存方便、再生產性，以及用于靶向特定細胞類型的可調的官能性。
[0006] 在各種類型的非病毒載體中，支化聚乙烯亞胺（重均分子量（Mw)為25kDa，數均 分子量（Mn)為10kDa，在本文中稱為bPEI-25)，其含有伯、仲和叔胺基團，提供了高的體 外基因轉染效率，并且視為工業標準。bPEI-25在生理pH下具有高陽離子電荷密度，其中 bPEI-25中的約20%的胺基團（即伯胺）被質子化。這使得bPEI-25能夠與帶負電的核酸 在寬泛的pH范圍內靜電相互作用并且使它們能夠復合成納米粒子。一旦bPEI-25/核酸納 米復合物被細胞吸收同化，那么仲胺和叔胺促進核酸從核內體通過"質子海綿效應"釋放。 對于脫氧核糖核酸（DNA)，所釋放的核酸被攝入細胞核給予了高的基因轉移效率。
[0007] 盡管有著高的基因轉染效率，bPEI-25的凈正電荷具有涉及以下的主要缺點，即， 涉及毒性、聚集以及bPEI-25/核酸復合物與細胞組分和非細胞組分（尤其在體內）的不期 望的非特異性相互作用。副作用包括肝壞死、聚集的血小板的粘連以及更高劑量的全身注 射之后的休克。
[0008] 考慮到bPEI-25所面臨的細胞毒性問題，低分子量支化聚乙烯亞胺（Mw為約 2. 0kDa，Mn為約1. 8kDa，在本文中稱為bPEI-2)也已獲得關注，這是由于其有利的細胞毒性 譜。當用于體內治療目的時，低分子量使得bPEI-2可以從腎臟排泄。然而，bPEI-2的主要 缺點是其低效的轉染能力，使其不足以用作基因轉染載體。
[0009] 因此，對于開發更有效且細胞毒性更低的用于遞送生物活性材料的聚乙烯亞胺衍 生物，存在著持續的需求。
[0010] 概述
[0011] 因此，公開了支化聚胺，其包含：
[0012] 約8至約12個骨架叔胺基團，約18至約24個骨架仲胺基團，大于0的正數n'個 骨架末端伯胺基團，以及大于〇的正數q個通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯基團：
[0013]
【主權項】
1. 支化聚胺，其包含： 約8至約12個骨架叔胺基團，約18至約24個骨架仲胺基團，大于O的正數η'個骨架 末端伯胺基團，以及大于〇的正數q個通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯基團： 其中：
(n' +q)為等于約8至約12的數， 通式（2)的星號鍵與所述支化聚胺的骨架氮連接， L'為包含3至30個碳的二價連接基團，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于約 9 % 至約 40 %。
2. 如權利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺基本由η'個伯氮丙啶重復單元、 約18至約24個仲氮丙啶重復單元、約8至約12個叔氮丙啶重復單元以及q個通式（2)的 氨基甲酸酯基團組成。
3. 如權利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺是數均分子量為約1600至約 5000的氨基甲酸酯官能化的支化聚乙烯亞胺。
4. 如權利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺的基因復合物在N/P 10至N/P 50下為非細胞毒性的。
5. 如權利要求1所述的支化聚胺，其中L'包含苯基脲部分。
6. 如權利要求1所述的支化聚胺，其中q/ (n'+q) X 100%等于約9%至約25%。
7. 如權利要求1所述的支化聚胺，其中qAn'+q) X 100%等于約9%至約12%。
8. 如權利要求1所述的支化聚胺，其中所述氨基甲酸酯基團是不帶電的。
9. 如權利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺不含季胺基團。
10. 支化聚胺，其包含： 約8至約12個骨架叔胺基團，約18至約24個骨架仲胺基團，大于0的正數η'個骨架 末端伯胺基團，以及大于〇的正數q個通式（4)的骨架末端氨基甲酸酯基團：
其中 通式（4)的星號鍵與所述支化聚胺的骨架氮連接， R1為氫、甲基或乙基， R2為氫或包含1至27個碳的單價基團， (n' +q)為等于約8至約12的數，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于約 9 % 至約 40 %。
11. 如權利要求10所述的支化聚胺，其中R2為酯*_C( = 0) OR3,其中R3包含1至26個 碳。
12. 方法，其包括： 用環狀碳酸酯單體處理包含約8至約12個伯胺基團、多個仲胺基團和多個叔胺基團的 支化第一聚合物而不使所述環狀碳酸酯單體聚合，從而形成包含以下的支化聚胺：i)約8 至約12個骨架叔胺基團，ii)約18至約24個骨架仲胺基團，iii)大于O的正數η'個骨架 末端伯胺基團，以及iv)大于〇的正數q個通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯基團：
其中： (n' +q)為等于約8至約12的數， 通式（2)的星號鍵與所述支化聚胺的骨架氮連接， L'為包含3至30個碳的二價連接基團，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于約 9 % 至約 40 %。
13. 如權利要求12所述的方法，其中所述環狀碳酸酯單體包含一種或多種保護基，并 且所述方法還包括從所述支化聚胺選擇性地去除所述一種或多種保護基。
14. 如權利要求12所述的方法，其中所述環狀碳酸酯為6元環的環狀碳酸酯。
15. 如權利要求12所述的方法，其中所述支化第一聚合物為具有基本由以下組成的骨 架的支化聚乙烯亞胺： 約25mol %的具有以下結構的伯氮丙啶重復單元
約50mol %的具有以下結構的仲氮丙啶重復單元
約25mol%的具有以下結構的叔氮丙啶重復單元
其中各星號鍵表示與所述骨架的另一重復單元的連接點。
16. 如權利要求12所述的方法，其中所述環狀碳酸酯單體選自：
17.復合物，其包含： 基因；以及 支化聚胺，其包含約8至約12個骨架叔胺基團，約18至約24個骨架仲胺基團，大于O 的正數η'個骨架末端伯胺基團，以及大于O的正數q個通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯基 團： 其中：
(n' +q)為等于約8至約12的數， 通式（2)的星號鍵與所述支化聚胺的骨架氮連接， L'為包含3至30個碳的二價連接基團，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于約 9 % 至約 40 %。
18. 處理細胞的方法，其包括使細胞與權利要求17所述的復合物接觸。
19. 如權利要求18所述的方法，其中所述細胞為人類腫瘤細胞。
20. 如權利要求18所述的方法，其中所述細胞為肝癌細胞。
21. 如權利要求18所述的方法，其中所述細胞為卵巢癌細胞。
22. 支化聚胺，其具有通式（5)的結構：
其中j、k、m、η'和q表示大于0的摩爾數，j具有約35至約47的值，k具有約8至約 12的值，m具有約18至約24的值，（n' +q)具有約8至約12的值，以及qAn' +q) X 100 %具 有約9 %至約40 %的值，并且各Z'為選自以下的獨立部分
【專利摘要】支化聚胺包含約8至約12個骨架叔胺基團，約18至約24個骨架仲胺基團，大于0的正數n'個骨架末端伯胺基團，以及大于0的正數q個通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基團；其中(n'+q)為等于約8至約12的數，通式(2)的星號鍵與支化聚胺的骨架氮連接，L'為包含3至30個碳的二價連接基團，以及q/(n'+q)×100％等于約9％至約40％。
【IPC分類】C08G73-02, A61K47-48, C08L79-02
【公開號】CN104755534
【申請號】CN201380056058
【發明人】程薇, 丹尼爾·J·克迪, 阿曼達·C·恩格樂特, 詹姆士·L·海德瑞克, 張貝云, 楊川, 楊義燕
【申請人】囯際商業機器公司, 新加坡科技研究局
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年9月4日
【公告號】EP2895527A1, US9109087, US20140073048, WO2014042922A1