鮑曼不動桿菌攜帶qacE*1-sull基因的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種鮑曼不動桿菌攜帶耐消毒劑qacEA l-sull基因的檢測方法，屬于分子生物學技術領域。
【背景技術】
[0002]qacEAl基因是一種耐消毒劑基因，位于I類整合子中，I類整合子是編碼抗菌素耐藥基因盒的良好載體，暴露于季銨類消毒劑環境下的細菌可因環境壓力選擇對該類消毒劑耐藥。qacEA Ι-sull基因的表達產物為外排泵，可將季胺鹽類化合物、雙胍類化合物、腙類化合物、堿性染料等排出細菌胞外，從而產生季胺鹽類消毒劑和雙胍類消毒劑的耐藥性，再加上還有sull編碼基因，可編碼二氫蝶酸合成酶，使細菌對磺胺類藥物也耐受。
[0003]革蘭陰性桿菌廣泛存在于自然界的土壤、醫院環境及人體皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，構成了醫院感染的重要病原菌群。鮑曼不動桿菌為非發酵革蘭陰性桿菌，屬于條件致病菌，隨著廣譜抗生素的大量應用，分離率呈逐年上升，且耐藥模式以多重耐藥和泛耐藥為主，給臨床治療帶來極大挑戰。盡管對鮑曼不動桿菌的醫院感控措施不斷加強，但由其所致的克隆傳播或爆發流行仍常有報道，原因與細菌對臨床常用消毒劑耐受有關。對臨床分離的鮑曼不動桿菌中qacEAl-sull陽性的檢出，可為醫療機構提供現有的細菌耐消毒劑狀況分析，進而對感染控制措施(清潔衛生和消毒滅菌)做出相應改進。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種鮑曼不動桿菌攜帶耐消毒劑qacE Δ 1-sull基因的檢測方法。
[0005]為了達到上述目的，本發明提供了一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測耐消毒劑qacE Δ 1-sull基因基因攜帶情況的方法，其特征在于，具體步驟為:
第一步:從臨床分離環境標本中的鮑曼不動桿菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶qacEA Ι-sull基因的銅綠假單胞菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成qacE Δ 1-sull序列，構建攜帶qacE Δ 1-sull基因的重組質粒為陽性對照品；全部菌株均使用法國梅里埃公司VITEK32全自動微生物分析儀鑒定菌種。
[0006]第二步:用無菌水配制濃度為5-15umol/L的qacEA Ι-sull基因正向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的qacEA Ι-sull基因反向引物溶液；qacEA Ι-sull基因正向引物的序列為:5' - tcggtgttgcttatgcagtc-31 , qacE Δ 1-sull 基因反向引物的序列為:5'-gcaattatgagccccatacc-3'；
第三步:在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的qacE Δ 1-sulI基因正向引物溶液0.5ul、qacE Δ l_sulI基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品各2ul，用滅菌重蒸餾水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為92_97°C變性5_15分鐘，92-97 °C 變性 10-30 秒，57-65 °C 退火 10-30 秒，70-75 °C 延伸 10-30 秒，30-50 個循環；HRM反應條件:92-97°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95 °C，過程中實時監測熒光信號，30-50次每秒。
[0007]第四步:應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結果，有擴增曲線的即為攜帶qacE Δ 1-sull 基因。
[0008]本發明是對鮑曼不動桿菌中是否攜帶耐消毒劑qacEA 1-sull基因進行檢測，細菌一旦獲得此基因即可對現用的消毒劑耐受，使消毒劑失效，通過檢測了解qacEA Ι-sull基因的攜帶情況，有利于對含有耐消毒劑基因的菌株的監控，防止菌株繼續流行，同時從科研角度對其耐藥機理的進一步了解還有利于新的滅菌制劑的研制開發。
[0009]本發明基于HRM分析技術，無需序列特異性探針，采用新型飽和染料，操作簡單，不僅具有靈敏度高、特異性好、成本低、檢測速度快、高通量等優點，而且分辨率高，全部反應在封閉的反應管中完成，有效避免了交叉污染。
【附圖說明】
[0010]圖1為本發明實施例樣本的HRM擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0011]以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
實施例
[0012]1、從臨床分離環境標本中的鮑曼不動桿菌株，高溫滅活，用商品化的細菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術有限公司，YP03002)提取樣本DNA，稀釋至30ul (濃度lOng/ul)，置-20°C保存，待用；將標準銅綠假單胞菌株(保藏單位:中國農業微生物菌種保藏管理中心，保藏編號:ATCC? Number: 27853)，高溫滅活，用商品化的細菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術有限公司，YP03002)提取樣本DNA，稀釋至30ul (濃度10ng/ul)，作為陰性對照品；人工合成qacEA Ι-sull序列(由上海生工合成)，構建攜帶qacE Δ Ι-sull基因的重組質粒,稀釋至30ul (濃度10ng/ul),為陽性對照品。全部菌株均使用法國梅里埃公司VITEK32全自動微生物分析儀鑒定菌種。
[0013]2、根據qacE Δ Ι-sull基因的保守區域,采用在線軟件Primer 3設計引物,確定最佳引物為18-24bp大小，PCR產物長度130bp左右(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。用無菌水配制濃度為5-15umol/L的qacEA l_sull基因正向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的qacEA Ι-sull基因反向引物溶液；qacEA Ι-sull基因正向引物的序列為:5' - tcggtgttgcttatgcagtc-3 1 , qacE Δ 1-sull 基因反向引物的序列為:5 '-gcaattatgagccccatacc-3'；
3、在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul (QIAGEN公司生產，包括 2 X HRM PCR Master Mix、10XPCR 緩沖液、Q-solut1n、EvaGreen Dye、HotStarTaqDNA聚合酶)和步驟2所得的qacEA Ι-sull基因正向引物溶液0.5ul、qacEA 1-sull基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入步驟I得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品各2ul,用滅菌重蒸懼水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為95°C變性10分鐘，95 °C變性10秒，57 °C退火10秒，72 °C延伸10秒，40個循環；HRM反應條件:95°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度65°C開始程序升溫熔解至95 °C，過程中實時監測熒光信號，40次每秒。
[0014]4、應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結果，如圖1所示，陽性對照品有擴增曲線，陰性對照品無擴增曲線，8例檢測樣品中有2例有擴增曲線，為攜帶qacEA Ι-sull基因菌株。
【主權項】
1.一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測鮑曼不動桿菌中耐消毒劑qacEA 1-SUll基因攜帶情況的方法其特征在于，具體步驟為: 第一步:從臨床分離環境標本中的鮑曼不動桿菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶qacEA Ι-sull基因的銅綠假單胞菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成qacE Δ l_sull序列，構建攜帶qacE Δ l_sull基因的重組質粒為陽性對照品；全部菌株均使用法國梅里埃公司VITEK32全自動微生物分析儀鑒定菌種； 第二步:用無菌水配制濃度為5-15umol/L的qacEA l_sull基因正向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的qacE Δ 1-sull基因反向引物溶液；qacE Δ 1-sull基因正向引物的序列為:5' - tcggtgttgcttatgcagtc-31 , qacE Δ 1-sull 基因反向引物的序列為:5'-gcaattatgagccccatacc-3'； 第三步:在每一個PCR反應孔中依次加入Type-1t HRM PCR Mix 7.5ul和第二步所得的qacE Δ 1-sulI基因正向引物溶液0.5ul、qacE Δ l_sulI基因反向引物溶液0.5ul，然后在不同的PCR反應孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品各2ul，用滅菌重蒸餾水補足15ul ;在Rotor-Gene Q上進行反應，PCR反應條件為92_97°C變性5_15分鐘，92-97 °C 變性 10-30 秒，57-65 °C 退火 10-30 秒，70-75 °C 延伸 10-30 秒，30-50 個循環；HRM反應條件:92-97°C變性I分鐘，40°C復性I分鐘，初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95 °C，過程中實時監測熒光信號，30-50次每秒； 第四步:應用Rotor-Gene Q軟件分析HRM結果,有擴增曲線的即為攜帶qacE Δ 1-sull基因。
【專利摘要】本發明公開了一種利用高分辨熔解曲線分析技術檢測鮑曼不動桿菌中是否攜帶耐消毒劑qacE?1-sull基因的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：提取菌株樣本DNA，設計目的基因的檢測引物，根據高分辨熔解曲線分析技術對PCR擴增后的基因進行分析。本發明靈敏度高、特異性好，檢測速度快。
【IPC分類】C12R1-01, C12Q1-68, C12Q1-04
【公開號】CN104745706
【申請號】CN201510159854
【發明人】張奕, 毛丹丹, 王校, 何駿奇
【申請人】上海中優醫藥高科技有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年4月7日