一種食管癌相關甲基化生物標志物及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于癌癥預防領域，尤其涉及一種食管癌相關甲基化生物標志物及應用。
【背景技術】
[0002] 食管癌是常見的消化系統惡性腫瘤，以南部和東部非洲、東亞地區發病率最高。中 國是食管癌高發區之一，發病率比美國高20到30倍。除了眾所周知的行為與膳食因素與 食管癌發生有關之外，個體遺傳因素也不容忽視。近年來，隨著分子生物學和對腫瘤起源機 制認識的不斷深入，表觀遺傳異常在腫瘤發生中的作用日益受到關注。
[0003] 表觀遺傳改變的主要形式之一是DNA甲基化，這是哺乳類動物遺傳外修飾的一種 重要調控方式，也是脊椎動物DNA惟一的自然化學修飾方式。DNA甲基化主要發生在富含 CG島的基因啟動子區。啟動子區的CG島發生甲基化后可以導致基因轉錄受抑制，蛋白表達 量減少，相應功能下降甚至喪失。由于DNA甲基化模式還具有腫瘤特異性，即不同類型的腫 瘤可能存在不同的DNA甲基化譜，通過識別DNA異常甲基化譜并構建特異文庫可作為潛在 的分子生物標志物用于食管癌的診斷。
[0004] 傳統的食管癌診斷方法包括X線、CT、核磁共振、胃鏡檢查等，但均存在敏感性低 和早期病灶難以發現等缺點。尋找快速、簡便、靈敏、特異的早期診斷方法成為當前食管癌 防治工作中的一項重要任務。與傳統的蛋白類生物標志物相比，DNA甲基化改變常常是細 胞癌變過程中更為早期的事件，如果能夠建立合理的多指標的DNA甲基化圖譜，在疾病的 早期階段即采用分子生物學技術識別出這種特異性變化，無疑對實現食管癌"三早"將具有 極重要意義。
[0005] 早在上個世紀七、八十年代，科學家們就已經發現腫瘤患者的外周血中存在一種 來源于腫瘤灶的游離DNA (cell free DNA)。近幾年游離DNA在腫瘤的診斷和預后中的作用 日益受到重視，成為一個具有廣闊應用前景的生物標志物。實體惡性瘤能通過細胞壞死或 凋亡釋放大量的DNA進入體循環，分子大小在500bp~30kb之間。近年來的研宄表明，人外 周血游離DNA的量和質的改變與疾病發生發展關系密切，有希望成為疾病診斷、療效評估 及預后監測的一種重要分子標志物。游離DNA的遺傳特征與對應的腫瘤組織高度一致，如 存在相似的基因突變、微衛星不穩定性和雜合性缺失，并且具有一致的表觀遺傳改變特征。 在循環DNA研宄中的一個重要發現是腫瘤患者的血漿/清中可同時檢測到循環DNA的異常 甲基化，而且外周血循環DNA的甲基化模式與癌組織一致，這一發現為無創性DNA甲基化譜 分析提供了可能。
[0006] 由于抑癌基因異常甲基化是腫瘤發生過程的早期事件，識別并構建甲基化譜文庫 對于食管癌早期診斷和預后具有重要的應用價值，尤其是識別外周血中腫瘤特異性DNA甲 基化譜更是為尋找無創性食管癌診斷標志物提供了線索。由于DNA甲基化可以通過外源藥 物逆轉，因而該研宄結果也具有潛在的腫瘤治療應用前景。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種食管癌相關甲基化生物標志物及應用，旨在解決現有 食管癌診斷方法包括X線、CT、核磁共振、胃鏡檢查等存在敏感性低和早期病灶難以發現等 問題。
[0008] 本發明是這樣實現的，一種食管癌相關甲基化生物標志物，通過在CASZ1、⑶H13 和ING2食管癌相關抑癌基因中檢測到的特定CG位點甲基化頻率為生物標志物。
[0009] 該生物標志物獲取的具體過程包括：采用EDTA真空抗凝采血管采集待測者的外 周靜脈血，分離上層血衆，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取血衆循環DNA， 采用EZ DNA Methylation Kit進行亞硫酸氫鹽修飾。修飾后的血衆循環DNA采用質譜法 檢測相關基因CG位點的甲基化。
[0010] 本發明進一步提供了上述食管癌相關甲基化生物標志物在篩查、預判、防治待檢 者罹患食管癌方面的應用。
[0011] 通過檢測樣品中CASZ1、⑶H13和ING2的甲基化頻率可以輔助判斷待檢者罹患食 管癌的可能性大小，在患者發生食管癌的早期即可識別，有助于早發現、早診斷、早治療。
[0012] 相比于現有技術的缺點和不足，本發明具有以下有益效果：
[0013] (1)本發明以外周血循環DNA甲基化作為生物標志物用于食管癌的早期篩查、預 判、防治，具有快速、簡便、靈敏、特異以及無創的優點，具有重要的應用價值。
[0014] (2)本發明生物標志物中DNA甲基化可以通過外源藥物逆轉，因而該研宄結果也 具有潛在的腫瘤治療應用前景。
【具體實施方式】
[0015] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于 限定本發明。
[0016] 實施例1食管癌相關甲基化生物標志物的獲取
[0017] 1、血液采集
[0018] 采用EDTA真空抗凝采血管采集患者空腹外周靜脈血3~5ml，3, 000轉/分鐘離 心10分鐘，小心吸取上層血漿置于離心管中，再次離心10分鐘，速度5, 000轉/分鐘，吸取 上層血漿置于另一凍存管，用于DNA甲基化檢測，待測樣本可置-80°C冷凍保存。
[0019] 2、DNA 提取
[0020] 米用 QIAamp Circulating Nucleic Acid kit 提取血衆 DNA。試劑盒由 Mini Columns， Tube Extenders， Elution Tubes， VacConnectors， Collection Tubes， Buffer ACL，Buffer ACB，Buffer ACW1，Buffer ACW2, Buffer AVE，Carrier RNA 以及蛋白酶 K 組 成。
[0021] 3、DNA 修飾
[0022] 采用美國EZ DNAMethylation Kit進行亞硫酸氫鹽修飾。試劑盒中包括 M-Dilution Buffer，CT Conversion Reagent，M-Binding Buffer，Zymo-SpinTMIC Column， M-Wash Buffer，M-Wash Buffe，M-Elution Buffer，Collection Tubes。修飾后的 DNA 樣 本放入-20 °C冰箱備用。
[0023] 4、甲基化檢測
[0024] 設計PCR引物，如下表1所示：
[0025] 表1血液樣本甲基化檢測的引物序列
【主權項】
1. 一種食管癌相關甲基化生物標志物，其特征在于，通過在CASZ1、⑶H13和ING2食管 癌相關抑癌基因中檢測到的特定CG位點甲基化頻率為生物標志物。
2. 權利要求1所述的食管癌相關甲基化生物標志物在篩查、預判、防治待檢者罹患食 管癌方面的應用。
【專利摘要】本發明提供了一種食管癌相關甲基化生物標志物及應用，采用EDTA真空抗凝采血管采集待測者的外周靜脈血，分離上層血漿，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取血漿循環DNA，采用EZ DNA Methylation Kit進行亞硫酸氫鹽修飾。修飾后的血漿循環DNA采用質譜法檢測CASZ1、CDH13和ING2食管癌相關抑癌基因中CG位點甲基化頻率為生物標志物，該生物標志物用于食管癌的篩查、預判、防治。本發明具有快速、簡便、靈敏、特異以及無創的優點，且DNA甲基化可以通過外源藥物逆轉，因而該研究結果也具有潛在的腫瘤治療應用前景。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104745700
【申請號】CN201510142243
【發明人】王建明, 彭獻鎮, 薛恒川, 王建平, 沈燁
【申請人】南京醫科大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月27日