一種用于檢測百日咳桿菌的引物、探針和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種用于檢測百日咳桿菌的引物、探針和試 劑盒。
【背景技術】
[0002] 百日咳桿菌（Bordetella pertussis)是一種專性需氧的革蘭陰性小桿菌，屬于鮑 特氏菌屬，無芽孢，無鞭毛，新分離菌株為光滑型，具有莢膜和毒力。百日咳桿菌的唯一宿主 是人類，百日咳桿菌主要引起的百日咳，是一種急性呼吸系統疾病，傳染性強，人群普遍易 感，其中尤以嬰幼兒多見，是嚴重威脅人類健康的主要傳染病之一。好發于嬰幼兒和年齡偏 小的兒童，臨床表現為陣發性痙攣性咳嗽，帶有吸氣性尾聲和嘔吐，病程通常持續數周，小 嬰兒易并發肺炎、腦病、癲癇，從而需住院或導致死亡。
[0003] 在百日咳桿菌的免疫學檢測方法中，一般取疑似患者急性期與恢復期2份血清標 本進行檢測，這使得取樣時間較長，不利于百日咳桿菌的快速診斷，同時，免疫學檢測特異 性不高，不能準確檢測出百日咳桿菌。
【發明內容】
[0004] 為了解決現有技術中檢測百日咳桿菌的檢測速度慢且特異性不高的問題，本發明 實施例提供了一種用于檢測百日咳桿菌的引物、探針和試劑盒。所述技術方案如下：
[0005] -方面，本發明實施例提供了一種用于檢測百日咳桿菌的引物和探針，所述引物 和探針包括：用于檢測百日咳桿菌的正向引物、用于檢測百日咳桿菌的反向引物和用于檢 測百日咳桿菌的探針，其中，
[0006] 所述用于檢測百日咳桿菌的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示；
[0007] 所述用于檢測百日咳桿菌的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示；
[0008] 所述用于檢測百日咳桿菌的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示；
[0009] 所述探針的5'端連接有熒光基團FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述 探針的 3' 端連接有淬滅基團 TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
[0010] 另一方面，本發明實施例提供了一種用于檢測百日咳桿菌的試劑盒，所述試劑盒 包括上述的引物和探針。
[0011] 具體地，所述試劑盒還包括：核酸釋放劑、PCR反應液、臨界陽性質控品、陽性質控 品、陰性質控品和工作標準品。
[0012] 具體地，所述工作標準品包括：工作標準品1、工作標準品2、工作標準品3和工作 標準品4,其中，
[0013] 所述工作標準品1為含有1. 0X107拷貝/mL的百日咳桿菌基因片段；
[0014] 所述工作標準品2為含有1. OX 106拷貝/mL的百日咳桿菌基因片段；
[0015] 所述工作標準品3為含有1. OX 105拷貝/mL的百日咳桿菌基因片段；
[0016] 所述工作標準品4為含有1. OX 104拷貝/mL的百日咳桿菌基因片段。
[0017] 具體地，所述陽性質控品為1.0X106拷貝/mL的百日咳桿菌的基因片段。
[0018] 具體地，所述正向引物和所述反向引物的終濃度均為0.05-0. 9 yM，所述探針的終 濃度為 0.05-0. 9 yM。
[0019] 具體地，所述PCR反應液各組分在PCR擴增反應體系中包括：終濃度為0. 01U/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、終濃度為0. 2~0. 6mM的dNTPs、10XPCR緩沖液和終濃度為 1. 5~5. OmM的含Mg離子的溶液。
[0020] 具體地，所述核酸釋放劑包括無菌水、終濃度為0. 03-0. 3 %的聚乙二醇辛基苯基 醚、終濃度為0. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值為8. 3的終濃度為0. 01-0. 1M 的三（羥甲基）氨基甲烷。
[0021] 具體地，所述臨界陽性質控品為1. ox 104拷貝/mL的百日咳桿菌的基因片段。
[0022] 具體地，所述引物的終濃度為0. 05-0. 9 yM，所述探針的終濃度為0. 05-0. 9 yM。
[0023] 具體地，所述陰性質控品為濃度0. 8%的生理鹽水。
[0024] 本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是：本發明實施例提供的用于檢 測百日咳桿菌的引物和探針，具有靈敏度高的特性，使得本發明實施例提供的用于檢測百 日咳桿菌的試劑盒，具有靈敏度高的特性，采用儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀 性，其檢測結果可靠，提高了檢測的靈敏度，即使僅存在單拷貝的目的片段該試劑盒也可以 進行有效的檢測；檢測速度快，整個檢測過程共僅需2~3小時。
【附圖說明】
[0025] 為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于 本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他 的附圖。
[0026] 圖1是本發明實施例2提供的熒光擴增曲線圖；
[0027] 圖2是本發明實施例3提供的熒光擴增曲線圖；
[0028] 圖3是本發明實施例4提供的熒光擴增曲線圖；
[0029] 圖4是本發明實施例5提供的標準曲線的熒光擴增曲線圖；
[0030] 圖5是本發明實施例5提供的熒光擴增曲線圖；
[0031] 圖6是本發明實施例5提供的由圖4得到的標準曲線圖，圖6橫坐標為Log Starting Quantity copy number，縱坐標為 Threshold Cycle。
[0032] 圖中：Cycles 為循環數，RFU 為焚光值，Log Starting Quantity copy number 為 百日咳桿菌起始濃度的對數值，Ct (Threshold Cycle)值為循環數；la-實施例2中樣品1， 4a-實施例2中樣品4, 5a-實施例2中樣品5,6a-實施例2中樣品6, 7a-實施例2中樣品 7〇
【具體實施方式】
[0033] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明實施方 式作進一步地詳細描述。以下實施例中所用試劑和探針主要購自寶生物工程（大連）有限 公司。
[0034] 實施例1. 一種用于百日咳桿菌核酸定量檢測的引物和熒光探針
[0035] 本發明實施例提供了一種用于檢測百日咳桿菌的引物和探針，引物和探針包括： 用于檢測百日咳桿菌的正向引物、用于檢測百日咳桿菌的反向引物和用于檢測百日咳桿菌 的探針，其中，
[0036] 用于檢測百日咳桿菌的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示；
[0037] 用于檢測百日咳桿菌的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示；
[0038] 用于檢測百日咳桿菌的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示；
[0039] 探針的5'端連接有熒光基團？411、冊乂、了￡1\1(^、￥1(：、1?(?、〇73或〇75，探針的3' 端連接有淬滅基團TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本發明實施例中，探針 的熒光報告基團為FAM，FAM的激發波長為485nm，接收波長為527nm ;淬滅基團為Eclipse。 純化方式可選自：HAP、PAGE和HPLC純化方式，具體地引物和探針如下表：
[0040] 表1?百日咳桿菌引物和探針
【主權項】
1. 一種用于檢測百日咳桿菌的引物和探針，其特征在于，所述引物和探針包括：用于 檢測百日咳桿菌的正向引物、用于檢測百日咳桿菌的反向引物和用于檢測百日咳桿菌的探 針，其中， 所述用于檢測百日咳桿菌的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； 所述用于檢測百日咳桿菌的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示； 所述用于檢測百日咳桿菌的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示； 所述探針的5'端連接有熒光基團FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述探針 的 3' 端連接有淬滅基團 TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
2. -種用于檢測百日咳桿菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權利要求1所 述的引物和探針。
3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：核酸釋放劑、PCR反 應液、臨界陽性質控品、陽性質控品、陰性質控品和工作標準品。
4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述工作標準品包括：工作標準品1、工 作標準品2、工作標準品3和工作標準品4,其中， 所述工作標準品1為IX IO7拷貝/mL的所述百日咳桿菌的基因片段； 所述工作標準品2為I X IO6拷貝/mL的所述百日咳桿菌的基因片段； 所述工作標準品3為I X IO5拷貝/mL的所述百日咳桿菌的基因片段； 所述工作標準品4為I X IO4拷貝/mL的所述百日咳桿菌的基因片段。
5. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性質控品為1.0 X 10 6拷貝/mL 的所述百日咳桿菌的基因片段。
6. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的終濃 度均為0. 05-0. 9 y M，所述探針的終濃度為0. 05-0. 9 y M。
7. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液各組分在PCR擴增反應 體系中包括：終濃度為0.0 lU/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、終濃度為0. 2~0. 6mM的dNTPs、 10XPCR緩沖液和終濃度為1. 5~5. OmM的含Mg離子的溶液。
8. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸釋放劑包括無菌水、終濃度為 0.03-0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚、終濃度為0.04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH 值為8. 3的終濃度為0? 01-0.1 M的三（羥甲基）氨基甲烷。
9. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述臨界陽性質控品為1.0 X 10 4拷貝 AiL的所述百日咳桿菌的基因片段。
10. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性質控品為濃度0. 8%的生理 鹽水。
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測百日咳桿菌的引物、探針和試劑盒，屬于生物技術領域。所述引物和探針包括：用于檢測百日咳桿菌的正向引物、用于檢測百日咳桿菌的反向引物和用于檢測百日咳桿菌的探針。所述試劑盒包括上述的引物和探針。所述引物、探針和試劑盒，具有靈敏度高的特性，且檢測速度快，整個檢測過程共僅需2～3小時。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11, C12R1-01, C12Q1-04
【公開號】CN104745689
【申請號】CN201510050933
【發明人】劉茹, 桑筱筱
【申請人】湖北永邦醫療科技有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年1月30日