一種生物轉化丙烯醛合成丙烯酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及應用一株醋酸桿菌菌株靜息細胞及其固定化細胞轉化丙烯醛為丙烯酸的方法，屬于生物工程和酶工程領域。
【背景技術】
[0002]丙烯酸(Acrylic acid)，是工業生產中重要的不飽和有機酸，也是重要的有機原料，其分子中有特殊的雙鍵結構和酸性官能團。丙烯酸及其衍生物具有無色透明，有粘性、彈性，不易風化等優點，用于生產粘合劑、涂料、化纖、光敏樹脂板等化工產品。我國在生產高吸水樹脂、丙烯酸酯等領域對丙烯酸的需求逐年增加，丙烯酸的生產越來越受到重視。
[0003]目前丙烯酸的生產主要有化學法、微生物發酵法和生物轉化法。丙烯酸主要通過化學法從石油中獲得。工業化生產中大多采用丙烯氧化法，分為兩個階段:首先將丙烯氧化成丙烯醛，再進一步氧化為丙烯酸。丙烯氧化法具有原料價格低廉、回收率高等優點，在丙烯酸的生產中占有主導地位。
[0004]微生物發酵法主要是通過基因工程的方法構建工程菌，其主要的策略為在丙酸梭菌厭氧發酵過程中，乳酸可以轉化為丙烯酸。但是發酵法具有產量低、菌種不穩定、生產周期長、產物提純過程繁瑣、轉化率低、產品純度低、含等不足。
[0005]有研宄發現含有腈水合酶的紅球菌能夠利用全細胞將丙烯腈氧化催化為丙烯酸，但轉化率僅為63%。John等進行了 Rhodococcus AJ270的固定化和利用包埋生物催化劑來生產丙烯酸的研宄，成功地將丙烯酰胺催化成丙烯酸，得到了較高的轉化率，但由于丙烯酰胺的成本較高，很難實現工業化生產。
[0006]本發明的創新之處在于利用一株醋酸桿菌(Acetobacter sp.)靜息細胞高效轉化丙烯醛為丙烯酸的方法，具有微生物培養工藝簡單、轉化效率高、產物產量大、轉化液成分簡單利于產品分離純化、轉化過程可以人為地調節菌體濃度以縮短生產時間，節約大量的能源和生產成本，利于推廣。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的問題是提供一種利用醋桿菌生物轉化丙烯醛為丙烯酸的方法，利用所述醋桿菌靜息細胞及其固定化細胞，以丙烯醛為底物進行生物催化反應生產丙烯酸，具體步驟如下:
[0008](I)菌株的培養:發酵培養基:甘油20，甘露醇5，酵母膏5，蛋白胨1，硫酸銨2，硫酸鎂10，磷酸二氫鉀1，pH 6.0 ;培養溫度30°C ;搖床轉速200RPM ;培養時間32h，將發酵液離心獲得菌體。
[0009](2)催化反應體系的建立:菌體用適當的緩沖液配制成一定pH(6_8)的懸浮液，菌體濃度5-20g/L，加入終濃度為5-20g/L的丙烯酸，進行催化反應，催化溫度20_40°C，搖床轉速220RPM，催化時間15-120min。所述緩沖液可以為磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液；所用緩沖液體系濃度為0.lmol/L ；pH 6-8。
[0010](3)醋桿菌細胞的固定化:菌體經過32h培養后離心洗滌3次，傾去上清，與4%海藻酸鈉溶液以1:1?4的比例混合，注入0.05mol/L的CaCl2溶液中，固定化12h。
[0011]本發明的有益效果:本發明利用醋酸桿菌(Acetobacter sp.CGMCC N0.8142)及其固定化細胞在水相體系中高效的轉化丙烯醛為丙烯酸，在5-10g底物濃度范圍內，產物的轉化率高達91 %，該方法培養工藝簡單、轉化效率高、轉化液成分簡單利于產品分離純化、產物產量大、轉化過程可以人為地調節菌體濃度以縮短生產時間，節約大量的能源和生產成本。
【附圖說明】
[0012]圖1:丙烯酸標樣液相色譜圖
[0013]圖2:靜息細胞轉化產物液相色譜圖
[0014]圖3:丙烯酸標樣質譜圖
[0015]圖4:靜息細胞轉化產物質譜圖
【具體實施方式】
[0016]實施例1 Acetobacter sp.轉化丙稀醛為丙稀酸能力的鑒定
[0017]將篩選得到的單菌落接入種子培養基(50mL/250mL)中，30°C，220RPM培養16h后，以10%的接種量接入發酵培養基中，30°C，220RPM培養36h后，離心獲得菌體，將菌體用pH6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，用pH6.0的磷酸鹽緩沖液將菌體懸浮，制成菌體濃度1g/L的菌懸液，加入一定量的底物丙烯醛，使其終濃度為15g/L，在30°C，220RPM下催化60min內取樣，轉化液經離心去除菌體，0.22um的水相濾膜過濾后進行HPLC和質譜檢測。
[0018]經過HPLC檢測得到丙烯酸標準品的出峰時間在9.764min左右(附圖1)，轉化液經HPLC在相同條件下檢測發現中存在很明顯的峰，出峰時間在9.756min左右(附圖2)，與標準品出峰時間很吻合。將3-羥基丙酸的標準品與轉化液進行ES1-MS檢測，比較質樸圖發現兩者存在相同的m/z = 71特征峰(附圖3、4)由此可以判斷篩選得到的菌株具有轉化丙烯醛為丙烯酸的能力。
[0019]實施例2 Acetobacter sp.靜息細胞催化丙稀醛產丙稀酸
[0020]將培養32h的菌體離心洗滌后，分別用pH 6.0，6.4，6.8，7.2，7.6，8.0的0.1mmol/L的磷酸鹽緩沖液將菌體制成5g/L，10g/L，15g/L，20g/L的菌懸液，加入丙烯醛至終濃度分別為 5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，在 30°C，220RPM 下催化 90min，反應產物經 HPLC 檢測，在 pH6.8，菌體濃度為10g/L時其產量達到10.32g/L、轉化率為80%。
[0021]實施例3 Acetobacter sp.固定化細胞催化丙稀醛產丙稀酸
[0022]將Acetobacter sp.細胞在培養基中培養32h后經離心洗滌，與0.05mol/L的海藻酸鈉溶液以1:1?4的比例混合，分別加入pH 4.8,5.2,5.6,6.0的0.2mmol/L的醋酸鈉-醋酸緩沖液，使菌體濃度為10g/L，在30 °C，220RPM搖床轉速下反應90min。經HPLC檢測發現，當離心后的菌體與海藻酸鈉溶液比例為1:1，PH 6.0時丙烯酸產量最高，為11.51g/L，轉化率為90%。
[0023]實施例4 Acetobacter sp.固定化細胞的重復利用
[0024]在30°C條件下，將10g/L固定化細胞在pH 6.0的0.2mmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液體系中與10g/L丙稀醛反應，每90min收集固定化顆粒，在相同條件下重新與10g/L丙稀醛反應，經HPLC檢測，4次重復利用后，丙烯酸的產量為8.49g/L，轉化率高達75%。
[0025]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1.一種利用醋桿菌(Acetobacter sp.)高效生物轉化丙稀醛生產丙稀酸的方法，其特征在于，收集培養后的微生物菌體，以其靜息細胞或固定化細胞為生物催化劑，以丙烯醛為底物進行催化反應生產丙烯酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)醋桿菌的培養:在30°C條件下，將醋酸菌在培養基中培養32h; (2)靜息細胞催化反應:將發酵培養32h的菌體離心洗滌后制成一定濃度的菌懸液，加入丙烯醛，在20-40 °C和220RPM搖床轉速下催化15_120min，反應完成后進行HPLC檢測。 (3)固定化細胞反應:將離心后的菌體用海藻酸鈉溶液包埋，制成固定化醋桿菌顆粒，在緩沖體系中進行催化反應并用HPLC檢測。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的碳源為甘油20g/L，甘露醇 5g/L，酵母膏 5g/L，蛋白胨 lg/L，(NH4) 2S042g/L, KH2PO41g/L,MgSO4.7Η20 lg/L，pH 6.0。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的靜息細胞催化體系為檸檬酸-檸檬酸鉀緩沖液、磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液；所用緩沖液體系濃度為0.lmol/L ;pH范圍在6-8 ;固定化催化時所用的緩沖液為乙酸鈉-乙酸緩沖液，緩沖液體系濃度為0.2mol/L，pH 6.00
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述菌懸液濃度為5-20g/L。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述底物丙烯醛終濃度為5-20g/L。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述海藻酸鈉溶液濃度為4%。
【專利摘要】本方法公開了一種利用醋酸桿菌(Acetobacter sp.CGMCC NO.8142)靜息細胞及其固定化細胞生物轉化丙烯醛為丙烯酸的方法，屬于生物工程和酶工程領域。本發明的創新之處在于微生物培養方法簡單，轉化效率高，轉化液成分簡單，利于產品分離純化，反應條件溫和，節約大量的能源和生產成本。
【IPC分類】C12R1-02, C12P7-40
【公開號】CN104745645
【申請號】CN201510073804
【發明人】諸葛斌, 王旭昌, 宗紅, 陸信曜, 宋健, 方慧英, 諸葛健, 黨藝文
【申請人】江南大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年2月11日