一種新的快速雞胚盤的分離方法
【技術領域】
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[0001]本發明涉及干細胞工程、珍稀物種的保存和組織與細胞工程等領域。
技術背景:
[0002]目前對雞胚盤的分離主要有三種方法，藥勺獲取法，濾紙紙環法和發環法。這三種方法都需要通過去除新鮮受精蛋鈍端蛋殼和殼膜，使其成直徑3?4cm的圓孔，暴露出卵黃及胚盤，然后再進行胚盤的分離。藥勺法主要采用眼科剪順著胚盤的邊緣小心剪取胚盤，藥勺圉出后放入到盛有37°C的PBS的培養皿中。輕輕晃動培養皿，使卵黃和卵黃膜從胚盤上脫離下來。然后用藥勺小心翼翼地將胚盤從培養皿中取出，放入另一盛有溫熱PBS的培養皿中，進行后續試驗。紙環法，剪一濾紙圈，中央圓孔的直徑略大于胚盤，將紙圈輕壓到蛋白下面，使之與胚盤緊貼，并使胚盤位于圓孔中央。左手執眼科鑷子夾住紙圈邊緣，右手用剪刀沿紙圈剪下(胚盤邊緣粘連在紙圈上，胚胎完整)，用鑷子將紙圈移入到盛有溫熱PBS的培養皿中，輕輕晃動使胚盤上面的卵黃膜及其下面的卵黃去掉，進行后續試驗。發環法是將圓形胚盤剪開，挑入盛有溫熱PBS的培養皿中。用頭發環層層剔除蛋黃，再用PBS洗滌幾次，直到完全去掉蛋黃及蛋黃膜，進行后續試驗。
【發明內容】
:
[0003]針對目前雞胚盤分離時間長、效率低且分離胚盤不完整、卵黃顆粒殘留較多等問題，本發明采用僅使用鑷子分離胚盤的快速分離方法，具有分離速度快、純度高及胚盤完整等優勢。采用本方法，每小時兩人平均可分離雞胚100枚，與傳統方法比較發現，以目前常用的藥勺法為例，每小時兩人可分離雞胚50枚，提高效率兩倍，并且分離的雞胚盤更加的完整，卵黃顆粒更少，純度更高。發明提出的快速雞胚盤的分離方法具有巨大的應用前景，為雞胚胎干細胞的研宄體提供了重要的技術保障。
[0004]本發明目的在于為人們提供一種新的快速雞胚盤的分離方法。
[0005]本發明包括以下步驟:
[0006]1.雞胚的清洗
[0007]選用出生后未孵化的第X期新鮮受精種蛋，使用醫用紗布浸潤濃度為0.1%新潔爾滅，對種蛋進行徹底清洗后，使用75%的酒精再次徹底消毒備用；
[0008]2.試劑及器械的準備；
[0009]配制pH值為7.5的IXPBS緩沖液1L，高壓后備用。準備6個90mm培養皿，2把1cm眼科直鑷，2把14cm直剪刀，2只16cm吸管，兩塊50*50cm紗布，清洗烘干后，裝入不銹鋼高壓盒中高壓備用，酒精棉球若干；
[0010]3.超凈工作臺的清潔
[0011]醫用紗布經0.1 %新潔爾滅浸潤后對超凈工作臺進行徹底清洗，待其風干后再使用75%的酒精棉球消毒，然后用波長為250nm-260nm紫外線照射消毒30mins后通風使用；
[0012]4.操作人員準備
[0013]操作人員穿著白大褂，雙手經濃度為0.1%新潔爾滅消毒，再次使用75%酒精消毒，風干后，佩帶乳膠手套并開展試驗；
[0014]5.蛋殼的剝離
[0015]超凈工作臺通風15mins后，開始雞胚盤分離實驗，首先將雞胚鈍端向上握在手中，用鑷子尖頭輕輕在受精蛋中部鉆出一直徑為0.2-0.5cm小孔，將鑷子一端插入小孔，插入不要過深，0.2-0.5cm為宜，沿著赤道線方向，依次用鑷子夾碎蛋殼，用力不要過猛，僅夾碎鑷子中間蛋殼即可，延赤道線分離蛋殼一圈后，輕輕的剝離鈍端蛋殼，在此過程中應保持雞胚水平，防止卵黃隨蛋清流出；
[0016]6.蛋清的分離
[0017]剝離蛋殼后，手中剩余蛋殼部分緩慢傾斜15-20度角后，讓蛋清自然流出，部分未流出蛋清可用鑷子輕輕拖出，動作需謹慎，切勿將卵黃倒出，大部分蛋清分離后手中的蛋殼應恢復水平；
[0018]7.胚盤的尋找
[0019]使用鑷子的側面從卵黃的邊緣撥動旋轉卵黃，尋找受精胚盤，切勿使用尖端；
[0020]8.胚盤的形態特征識別
[0021]雞受精卵在母體內不斷分裂，產出后為X期，已經分裂成一團細胞，從卵黃的表面觀察為直徑約為0.5-0.6cm白色半透明圓盤，未受精蛋只能在卵黃表面觀察到一直徑為0.1-0.2cm不規則的白色小點；
[0022]9.胚盤的分離
[0023]找到胚盤后，用鑷子的側面將胚盤撥到正中央，用剪刀沿胚盤四周呈lcm*lcmE方形剪開，距離胚盤不宜過緊，每側留出0.3cm左右邊距，使用鑷子夾住將含有胚盤的的正方形卵黃膜一角，沿水平方向輕輕拉出來，保持水平，減少帶出的卵黃數量，將上述卵黃膜放入37°C的PBS的培養皿中，輕輕晃動培養皿，使卵黃和卵黃膜從胚盤上脫離下來，從而獲得了完整的胚盤。
[0024]本方法的發明，主要為了提高雞胚盤的分離效率，并且獲得完整的胚盤，減少卵黃顆粒的殘留。
[0025]采用本方法，每小時兩人平均可分離雞胚100枚，與傳統方法比較發現，以目前常用的藥勺法為例，每小時兩人可分離雞胚50枚，提高效率兩倍，大大縮短胚盤的分離時間，提高分離效率，并且分離的雞胚盤更加的完整，且卵黃顆粒殘留較少，純度更高。
[0026]本發明的優越性在于:
[0027]1.分離速度快；
[0028]2.方法簡單易行，可重復性強，在普通實驗室即可進行；
[0029]3.運用該方法獲取的胚盤完整，能夠滿足一般試驗的需要；
[0030]4.采用本方法，每小時2人平均可分離雞胚100枚，與傳統方法比較后發現:以目前常用的藥勺法為例，每小時2人可分離雞胚50枚，提高效率2倍，并且分離的雞胚盤更加完整，卵黃顆粒更少，每個胚盤可以獲得5-6萬個胚胎干細胞，且純度更高；
[0031]5.為禽類胚盤細胞的分離提供了新的方法，同時也為今后雞胚盤細胞后續研宄提供了方法和途徑；
[0032]6.該技術也適用于其它卵生動物的胚盤細胞的分離，可用于珍貴物種的利用與開發。
【具體實施方式】
[0033]1.蛋殼的剝離
[0034]超凈工作臺通風15mins后，開始雞胚盤分離實驗，首先將雞胚鈍端向上握在手中，用鑷子尖頭輕輕在受精蛋中部鉆出一直徑為0.2-0.5cm小孔，將鑷子一端插入小孔，插入不要過深，0.2-0.5cm為宜，沿著赤道線方向，依次用鑷子夾碎蛋殼，用力不要過猛，僅夾碎鑷子中間蛋殼即可，延赤道線分離蛋殼一圈后，輕輕的剝離鈍端蛋殼，在此過程中應保持雞胚水平，防止卵黃隨蛋清流出；
[0035]2.蛋清的分離
[0036]剝離蛋殼后，手中剩余蛋殼部分緩慢傾斜15-20度角后，讓蛋清自然流出，部分未流出蛋清可用鑷子輕輕拖出，動作需謹慎，切勿將卵黃倒出，大部分蛋清分離后手中的蛋殼應恢復水平；
[0037]3.胚盤的尋找
[0038]使用鑷子的側面從卵黃的邊緣撥動旋轉卵黃，尋找受精胚盤，切勿使用尖端；
[0039]4.胚盤的形態特征識別
[0040]雞受精卵在母體內不斷分裂，產出后為X期，已經分裂成一團細胞，從卵黃的表面觀察為直徑約為0.5-0.6cm白色半透明圓盤，未受精蛋只能在卵黃表面觀察到一直徑為0.1-0.2cm不規則的白色小點；
[0041]5.胚盤的分離
[0042]找到胚盤后，用鑷子的側面將胚盤撥到正中央，用剪刀沿胚盤四周呈lcm*lcmE方形剪開，距離胚盤不宜過緊，每側留出0.3cm左右邊距，使用鑷子夾住將含有胚盤的的正方形卵黃膜一角，沿水平方向輕輕拉出來，保持水平，減少帶出的卵黃數量，將上述卵黃膜放入37°C的PBS的培養皿中，輕輕晃動培養皿，使卵黃和卵黃膜從胚盤上脫離下來，從而獲得了完整的胚盤。
【主權項】
1.一種新的快速雞胚盤的分離方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)雞胚的清洗 選用出生后未孵化的第X期新鮮受精種蛋，使用醫用紗布浸潤濃度為0.1 %新潔爾滅，對種蛋進行徹底清洗后，使用75%的酒精再次徹底消毒備用； (2)試劑及器械的準備 配制PH值為7.5的IXPBS緩沖液1L，高壓后備用，準備6個90mm培養皿，2把1cm眼科直鑷，2把14cm直剪刀，2只16cm吸管，兩塊50*50cm紗布，清洗烘干后，裝入不銹鋼高壓盒中高壓備用，酒精棉球若干； (3)超凈工作臺的清潔 醫用紗布經0.1 %新潔爾滅浸潤后對超凈工作臺進行徹底清洗，待其風干后再使用.75%的酒精棉球消毒，然后用波長為250nm-260nm紫外線照射消毒30mins后通風使用； (4)操作人員準備 操作人員穿著白大褂，雙手經濃度為0.1%新潔爾滅消毒，再次使用75%酒精消毒，風干后，佩帶乳膠手套并開展試驗； (5)蛋殼的剝離 超凈工作臺通風15mins后，開始雞胚盤分離實驗，首先將雞胚鈍端向上握在手中，用鑷子尖頭輕輕在受精蛋中部鉆出一直徑為0.2-0.5cm小孔，將鑷子一端插入小孔，插入不要過深，0.2-0.5cm為宜，沿著赤道線方向，依次用鑷子夾碎蛋殼，用力不要過猛，僅夾碎鑷子中間蛋殼即可，延赤道線分離蛋殼一圈后，輕輕的剝離鈍端蛋殼，在此過程中應保持雞胚水平，防止卵黃隨蛋清流出； (6)蛋清的分離 剝離蛋殼后，手中剩余蛋殼部分緩慢傾斜15-20度角后，讓蛋清自然流出，部分未流出蛋清可用鑷子輕輕拖出，切勿將卵黃倒出，大部分蛋清分離后手中的蛋殼應恢復水平； (7)胚盤的尋找 使用鑷子的側面從卵黃的邊緣撥動旋轉卵黃，尋找受精胚盤，切勿使用尖端； (8)胚盤的形態特征識別； 雞受精卵在母體內不斷分裂，產出后為X期，已經分裂成一團細胞，從卵黃的表面觀察為直徑約為0.5-0.6cm白色半透明圓盤，未受精蛋只能在卵黃表面觀察到一直徑為.0.1-0.2cm不規則的白色小點； (9)胚盤的分離 找到胚盤后，用鑷子的側面將胚盤撥到正中央，用剪刀沿胚盤四周呈正方形剪開，距離胚盤不宜過緊，每側留出0.3cm左右邊距，使用鑷子夾住將含有胚盤的的正方形卵黃膜一角，沿水平方向輕輕拉出來，保持水平，減少帶出的卵黃數量，將上述卵黃膜放入.37°C的PBS的培養皿中，輕輕晃動培養皿，使卵黃和卵黃膜從胚盤上脫離下來，從而獲得了完整的胚盤。
【專利摘要】本發明公開了一種新的快速雞胚盤的分離方法：首先將雞胚鈍端向上握在手中，用鑷子尖頭輕輕在受精蛋中部鉆出一個小孔后，將鑷子一端插入小孔，沿著赤道線方向，依次用鑷子夾碎蛋殼，延赤道線分離蛋殼一圈后，輕輕的剝離鈍端蛋殼，在此過程中應盡量保持雞胚水平，防止卵黃隨蛋清流出；剝離蛋殼后，用鑷子將蛋清從卵黃中分離；使用鑷子的側面撥動卵黃，尋找胚盤；找到胚盤后，盡量將胚盤撥到正中央，用剪刀沿胚盤四周呈正方形剪開，此時，使用鑷子夾住將含有胚盤的正方形卵黃膜一角，沿水平方向輕輕拉出來，將此卵黃膜放入37℃的PBS的培養皿中，輕輕晃動培養皿,使卵黃和卵黃膜從胚盤上脫離下來，從而獲得了完整的胚盤。
【IPC分類】C12N5-073
【公開號】CN104745527
【申請號】CN201510193606
【發明人】李碧春, 張亞妮, 張振韜, 左其生, 李 東, 張蕾, 連超, 肖天榮, 湯貝貝
【申請人】揚州大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年4月22日