一種降解多環芳烴的不動桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一株不動桿菌菌株，本發明還涉及所述菌株在降 解多環芳烴中的應用以及一種降解多環芳烴的方法。
【背景技術】
[0002] 多環芳香烴化合物（PAHs)是一類由兩個或兩個以上苯環以線性排列、彎接或者 簇聚等不同方式排列形成的有機化合物。根據PAHs分子量的大小，可以將多環芳烴分為低 分子量的PAHs(如萘、菲，芴等）和高分子量的PAHs(如熒蒽、芘、苯并芘等）。多環芳烴的 來源主要包括兩個方面：一方面是自然界自身的活動，如森林火災、動植物遺體腐爛、石油 煤炭形成、火山噴發等；另外一個方面是人類活動，如化石的不完全燃燒、城市固體廢棄物 的焚燒、石油開采、加工運輸以及化工生產和汽車尾氣的排放等。人類活動向環境貢獻了絕 大多數的多環芳烴污染，是公認的主要污染來源。PAHs已經廣泛存在于空氣，水體和土壤及 其河流湖泊的沉積物，隨著全球人口數量的不斷增長以及城市化、工業化進程的不斷加劇， 人類生存環境中的多環芳烴的控制和修復已經變得刻不容緩。
[0003] 多環芳烴是一類環境持久性污染物。由于其獨特的化學結構，多環芳烴具有低水 溶性，高疏水性和強化學穩定性，在自然界中難以被生物體利用。同時，多環芳烴也是被廣 泛證實的具有致癌、致畸、致突變的"三致"效應的環境污染物。由于其獨特的化學穩定性， 傳統的物理化學方法（揮發、光解、化學氧化、電修復以及混凝絮凝等方法）難以去除，同時 處理成本高昂，容易產生二次污染。
[0004] 微生物修復是利用微生物將有機污染物轉化為碳基大分子和二氧化碳的過程， 實施和建立一套有機污染物的微生物修復工藝的核心是尋找代謝速度快，環境適應性強 的污染物降解菌，直接從環境中富集篩選微生物是一種最有效的技術手段，它具有定植能 力強，環境適應性廣等特點。目前人們已經從各類生態環境中篩選獲得多種多環芳烴降 解菌，包括假單胞菌（Pseudomonas)、紅球菌（Rhodococcus)、分枝桿菌（Mycobacterium)、 芽孢桿菌（Bacillus)、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas)、氣單胞菌（Aeromonas)、拜葉 林克氏菌（Beijerinckia)、擬諾卡氏菌（Nocardioides)、解環菌（Cycloclasticus)、 伯克氏菌（Burkholderia)、叢毛單胞菌（Polaromonas)以及一些嗜熱厭氧的菌屬 如嗜油菌（Neptunomonas)、兩面神菌（Janibacter)、諾卡氏菌（Nocardia)、變性菌 (Deltaproteobacteria)和產喊菌（Alcaligenes)等。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一株用于降解多環芳烴的不動桿菌。
[0006] 申請人從石油污染的土壤中分離獲得一株能夠快速降解多環芳烴的菌株，通過 生理生化鑒定和核糖體16SrDNA基因序列分析將其鑒定為不動桿菌屬（Acinetobacter sp.)，命名為W145。該菌株已于2014年5月9日送交位于湖北省武漢市武漢大學內的中國 典型培養物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏編號為：CCTCCNO:M2014192。
[0007] 該菌株能夠高效降解多環芳烴，尤其是菲、芘、熒蒽、萘。同時該菌株在pH5. 5~ 9. 0,以及鹽離子濃度<5%下，能快速生長，具有耐鹽堿和廣泛的酸堿度環境適應能力，是 對土壤、污水、淤泥中的多環芳烴進行降解的優秀生物材料。
[0008] 在降解土壤、污水、淤泥中的多環芳烴時，按每lKg污染物中接種105~10 7CFU的 不動桿菌W145,能達到最佳的降解效果。
[0009] 在接種前調節污染物的pH為5. 5~9. 0,以及鹽離子濃度< 5%，能達到較佳的降 解效果。
[0010] 在接種前調節污染物的pH為7. 2,以及鹽離子濃度為2%，能達到最佳的降解效 果。
[0011] 更詳細的技術方案見《具體實施方案》所述。
【附圖說明】
[0012] 圖1是不動桿菌W145對不同多環芳烴的降解能力。
[0013] 圖2是不動桿菌W145在250mg/L菲濃度下的生長和降解曲線。
[0014] 圖3是不動桿菌W145對pH值的敏感性柱狀圖。
[0015] 圖4是不動桿菌W145對鈉離子濃度的敏感性柱狀圖。 具體實施方案
[0016] 以下結合實施例對本發明進行詳細地說明。應該說明的是，本發明的實施例僅限 于對于本發明進行說明，而沒有限制作用。本發明中所涉及的其它各種操作，均為本領域的 常規技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發明申請日之前 的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等予以實施。
[0017] 實施例1不動桿菌W145的分離鑒定
[0018] 采用來自勝利油田長期受石油污染的土壤為篩選土壤，具體篩選方案如下：
[0019] 1)取10g土壤，加入到100ml含有250mg/L菲的無機鹽培養基MSM中，28°C震蕩培 養7天，取10ml培養物轉接到另100ml含有250mg/L菲的無機鹽培養基MSM中；連續轉接 5次，得到富集微生物的培養液。
[0020] 2)取0. 1ml步驟1)所得到的培養液，涂布到含250mg/L菲的MSM固體平板上，28°C 靜止培養5天后，將平板上長出來的菌落轉接到含250mg/L菲的MSM固體平板上，繼續培養 生長，直到平板上出現單一的菌落。
[0021] 3)挑取MSM固體平板上生長出來的單菌落，接種到含有250mg/L菲的MSM液體培 養基中，28 °C震蕩培養5天，獲得本發明的菌株。
[0022] 進一步對菌株進行了形態學和分子生物學鑒定。
[0023] 首先，對菌株的形態學特征進行了初步的觀察，結果表明，該菌株為革蘭氏陰性 菌，桿狀。
[0024] 同時，發明人分離獲得菌株的基因組DNA，然后以細菌16SrRNA基因的通用引物 27F和1492R引物對DNA進行PCR擴增；將獲得的PCR擴增產物進行測序，其序列如序列表 SEQIDN0:1所示。然后，利用NCBI核酸數據庫，根據菌株16SrRNA基因序列進行了BLAST 分析，結果表明菌株的16SrRNA基因序列與不動桿菌屬的同源性高達99%的相似性，結合 革蘭氏染色和形態學觀察，發明人將該菌株命名為不動桿菌（Acinetobactersp.)W145。
[0025] 實施例2不動桿菌W145對多環芳烴的降解能力驗證
[0026] 發明人對W145菌株對常見多環芳烴降解能力進行了研宄。以100ml不含有碳源 的MSM培養基為基礎，分別添加不同的多環芳烴作為唯一碳源；然后接入106CFU的不動桿 菌W145,置于28°C震蕩培養5天后，測定培養物在0D_的吸光度值。以不添加任何碳源的 培養基為負對照。由于培養基中未添加除多環芳烴外的任何碳源，因此菌株的生長速度和 生物量即體現了菌株對多環芳烴的降解和利用能力。
[0027] 如圖1所示，不動桿菌W145對熒蒽、芘、菲具有較強的降解能力，對萘也具有一定 的降解能力，而對其它的多環芳烴如聯苯、芴、苯并芘等幾乎沒有降解能力，表明不動桿菌 W145對多環芳徑的降解具有一定的專屬性。
[0028] 實施例3不動桿菌W145對多環芳烴的降解效率
[0029] 為了進一步分析不動桿菌W145對多環芳烴的降解效率，以菲為唯一碳源，對不動 桿菌W145的生長速度和降解速度進行了測試。將處于對數生長期的不動桿菌W14以1%接 種量接種到以250mg/L菲為唯一碳源的MSM培養基中，置于28°C震蕩培養。同時，每12個 小時測定一次培養物的〇D_值和殘留菲的濃度。
[0030] 如圖2所示，不動桿菌W145從接種開始就具備了菲降解能力，并且在12小時后降 解能力和菌株生長都迅速增加，并且，隨著培養物中殘留菲濃度的減少，菌株生長逐漸進入 平臺期。在接種100小時后，培養物中的菲幾乎完全被降解。這表明不動桿菌W145具有快 速高效降解多環芳徑的能力，能夠將液體培養基中的250mg/L的菲在五天內完全降解。
[0031] 實施例4不動桿菌W145的環境適應特征
[0032] 對不動桿菌W145對pH值和鹽離子濃度的適應性進行了測試。
[0033] 采用R2A培養基，分別利用MES(2-(N-嗎啉）乙磺酸），TAPS0(3-[N-三（羥甲基） 甲胺]-2-羥基丙磺酸），Tris-HCl將R2A液體培養基的pH值調整為5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、 7. 0、7. 2、8. 0、8. 5、9. 0 ;然后接種新鮮的不動桿菌W145到上述不同pH值的培養基中，28°C 震蕩培養24小時后測定其0D_，結果如圖3所示：不動桿菌W145在pH6. 0到pH9. 0范圍 內的生長，在pH低于5. 5時基本上沒有明顯的生長趨勢。這表明本發明所提供的不動桿菌 W145具有廣泛的pH適應性，具有修復酸性和堿性土壤的潛力。
[0034]與上述培養條件相似，同樣采用R2A培養基，在其培養基中添加NaCl，使其終濃度 分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10% ;然后接種新鮮的不動桿菌W145到 上述不同鈉離子濃度的培養基中，28°C震蕩培養24小時后測定其0D_，結果如圖4所示。不 動桿菌W145在添加4%以內的鈉離子的條件下其生長不受影響；添加鈉離子濃度達到5% 能夠維持不低于50%的生長，當在培養基中添加6%以上的鈉離子的時候，W145仍然有生 長的趨勢。這表明當采用不動桿菌W145進行有機污染物生物修復的時候，為了實現其菌株 的高效定植和維持其代謝活性，污染物中的鹽離子濃度應該控制在5 %以內。
[0035] 實施例5多環芳烴類有機污染物的降解
[0036] 取土壤或污水或淤泥，先調節pH為7. 2,鹽離子重量濃度為2%，然后按每lKg土 壤或污水或淤泥中接種1〇5~10 7CFU的不動桿菌W145,混勻。
【主權項】
1. 一株降解多環芳徑的不動桿菌（Acinetobacter sp. )W145,保藏在中國典型培養物 保藏中心，保藏編號為：M2014192,所述多環芳烴為菲、熒蒽、芘和萘。
2. 權利要求1所述的不動桿菌W145在降解多環芳烴中的應用。
3. -種降解多環芳烴的方法，其特征在于：包括向含有多環芳烴的污染物中接種權利 要求1所述不動桿菌W145的步驟。
4. 根據權利要求3所述的降解多環芳烴的方法，其特征在于：向每IKg含有多環芳烴 的污染物中接種IO5~10 7CFU的不動桿菌W145,所述污染物是土壤或污水或淤泥。
5. 根據權利要求3或4所述的降解多環芳烴的方法，其特征在于：還包括在接種前調 節污染物的pH為5. 5~9. 0,以及鹽離子濃度彡5%的步驟。
6. 根據權利要求5所述的降解多環芳烴的方法，其特征在于：還包括在接種前調節污 染物的pH為7. 2,以及鹽離子濃度為2%的步驟。
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，公開了一種不動桿菌(Acinetobacter sp.)W145，該菌株保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC NO：M2014192，本發明所公開的菌株對菲、熒蒽、芘和萘具有高效快速的降解能力，是對土壤或環境進行生物修復的優秀材料。CCTCC NO：M201419220140509
【IPC分類】C02F11-02, C02F3-34, C12R1-01, B09C1-10, C12N1-20, C02F101-32
【公開號】CN104745515
【申請號】CN201510159230
【發明人】黃巧云, 陳雯莉, 汪方奎, 李偲, 黃鳳齋
【申請人】華中農業大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年4月7日