用于操縱流體樣品中的組分的裝置和方法

用于操縱流體樣品中的組分的裝置和方法
【專利說明】用于操縱流體樣品中的組分的裝置和方法
[0001] 引言
[0002] 流式細胞術是研宄中被很好接受的工具，它允許用戶對樣品流體中的組分進行快 速分析和分選。流式細胞計數器使用載液（例如，鞘液（sheath fluid))以使樣品組分（實 質上一次一個組分）通過照射區。通過光源（例如激光）對每個樣品組分進行照射，并且 對由每個樣品組分散射的光進行檢測并分析。所述樣品組分可以在它們退出照射區時基于 它們的光學和其他特征來分離。
[0003] 流式細胞計數術常被用作對用于試驗的細胞進行分選和收集，所述試驗是例如體 內移植和體外細胞培養。例如，流式細胞計數術可被用于分離正經受干細胞移植的癌癥患 者的無腫瘤干細胞群（例如，造血干細胞）。流式細胞計數方法也越來越多地用在疾病診斷 和監測中，例如用于免疫異常的產前和新生兒診斷。流式細胞計數術的許多應用需要高速 地對細胞進行分析，分選、或收集，以最小化細胞的損傷、死亡、或聚集。進一步，可能需要高 效率以進行準確診斷。
[0004] 在某些應用中，流式細胞計數方法已合并了細胞磁性分離的步驟。細胞流經位于 適當配置的磁性分離裝置中的管或筒的磁性分離已顯示出是非常有效的。在磁性分離裝置 中，包括磁性標記的組分的樣品流體流經位于磁性分離裝置中的管，該磁性分離裝置包括 磁體。隨著該樣品流經該管，在該樣品中的磁性標記的組分通過由該磁體產生的磁場被保 留在該管中。未標記的組分（例如，細胞）不被保留在該管中并流經該磁性分離裝置。
[0005] 在使用前，常常必須洗滌并濃縮流經該磁性分離裝置的細胞。通常，這必然需要涉 及離心的手動步驟，該步驟可能會費時，損害所述細胞，或導致該樣品中的細胞的聚集。此 外，因為所述細胞通常必須長時間靜止，所以所述細胞形成聚集物的可能性高。
[0006] 概述
[0007] 提供了用于對液體樣品中所包含的組分（例如，細胞）進行操縱的裝置。在某些 方面，所述裝置包括磁性分離裝置和流體連接到磁性分離裝置上的聲學濃縮器裝置。本發 明的多個方面進一步包括用于對液體樣品中的細胞進行分選的方法，以及用于實踐該主題 方法的系統和用具包。
[0008] 本披露的實施例實現了高效、高流速以及低成本地分離液體樣品中的組分。在某 些方面，所述組分是細胞。感興趣的細胞包括但不限于原核細胞（例如，細菌細胞或古細菌 細胞）以及真核細胞（例如，哺乳動物細胞，例如神經細胞、肌細胞、上皮細胞（例如，循環 腫瘤細胞）、干細胞（例如，造血干細胞）、脂肪細胞等等）。細胞可以從一系列樣品來檢測， 所述樣品包括獲得自體外來源（例如，來自培養生長的實驗室細胞的細胞懸浮液）或來自 體內來源（例如，哺乳動物受試者、人類受試者、等）的樣品。
[0009] 在某些方面，使用裝置在液體樣品中對組分（例如，細胞）進行分選，該裝置包括 磁性分離裝置和被流體連接到該磁性分離裝置的聲學濃縮器裝置。在該主題裝置和系統 中，可包括寬范圍的磁性分離裝置和聲學濃縮器裝置，例如，如此處所述的。在某些方面，磁 性分離裝置包括一個或多個磁場源，例如2個或更多個，包括3個或更多個，4個或更多個， 或5個或更多個磁場源。磁性分離裝置可包括1個或多個磁場引導件，例如2個或更多， 包括3個或更多，4個或更多，或5個或更多。感興趣的磁場引導件包括但不限于具有錐形 (例如，頂端）邊緣的磁場引導件，該引導件被配置成增加來自磁場源的磁通量。
[0010] 此外，寬范圍的聲學濃縮器裝置可以包括在所述主題裝置和系統中，在一些實施 例中在關于以下方面而變化：規模（例如，大型或微型規模）；芯片材料（例如，硅、玻璃， 等）；芯片大小；分離通道的數目（例如，1個或多個，2個或更多個、5或更多個、10個或 更多個、20個或更多個、等）；分離通道的定向（例如，串行、并行、和/或兩者）；一個或 多個分離通道的大小；輸入和輸出的數目；振動發生器的類型（例如，壓電陶瓷轉換器，例 如鋯鈦酸鉛（PZT));振動發生器的數目；波動頻率；施加至振動發生器的電壓；流速（例 如，大約1 μ 1/min，大約100 μ 1/min，大約lml/min，或大約lOOml/min或更高）；泵或閥 的存在或不存在（例如，一個或多個注射泵、彈性泵、和/或蠕動泵）；等等，如在此將更 完整地描述的。進一步，感興趣的聲學濃縮器裝置包括但不限于在以下文獻中描述的那 些 ：美國專利號6,929,750;勞雷爾〇^1^611)，等人（2007)《化學學會綜述》（0^!11.5〇(3· Rev. )，2007, 36,492 - 506 ;彼得松（Petersson)，等人（2005)《分析化學》（Analytical Chemistry) 77:1216 - 1221;以及阿古斯特松（Augustsson)，等人（2009)《芯片上的實驗 室》（Lab on a Chip)9:810-818;將其披露通過引用結合于此。
[0011] 本披露的裝置和系統可以包括被配置成控制該裝置或系統的一個或多個處理器。 在某些方面，處理器可被配置成在磁性分離裝置中施加磁場。替代地，處理器也可被配置成 例如通過改變形狀、頻率、以及遞送至該振動發生器的電能功率中的一者或多者來控制聲 學濃縮器裝置。本披露的方面進一步包括閉合回路裝置和系統。
[0012] 本披露還提供用于在液體樣品中操縱多個組分的方法。在某些實施例中，所述方 法包括：將該樣品中的磁性標記的部分與非磁性標記的部分分離，從而生成第一分選的樣 品；并且聲學地濃縮該第一分選的樣品，以產生第二分選的樣品。在某些方面，所述方法進 一步包括收集該第二分選的樣品，和/或分析該分選的樣品。還提供了用于實踐所述主題 方法的用具包。
[0013] 附圖簡要說明
[0014] 當結合附圖閱讀時，本發明可以從以下詳細說明書得到最好的理解。以下圖包括 在附圖中：
[0015] 圖1是系統的圖解，根據本披露的實施例，該系統包括磁性分離裝置和被流體連 接到該磁性分離裝置的聲學濃縮器裝置。
[0016] 圖2是系統的流體配置圖表，根據本披露的實施例，該系統包括磁性分離裝置、聲 學濃縮器裝置、和流式細胞計數器。
[0017] 圖3a是描述了根據本披露的某些實施例位于磁性分離裝置中的一對楔形磁場引 導件之間的流道的配置的圖表。圖3b是描述了根據本披露的某些實施例位于磁性分離裝 置中的一對楔形磁場引導件之間的多個流道的配置的圖表。兩個流道位置鄰近于該楔形磁 場引導件的頂端。圖3c是描述了根據本披露的某些實施例位于磁性分離裝置中的一對楔 形磁場引導件之間的多個流道的另一種配置的圖表。在這些實施例中，位置鄰近于該楔形 磁場引導件的頂端的兩個流道可穿過一對沖壓密封板通過建立和膨脹中空通道而形成。
[0018] 圖4a是描述了根據本披露的某些實施例位于磁性分離裝置中的楔形磁場引導件 和平邊磁場引導件之間的多個流道的配置的圖表。圖4b是描述了根據本披露的某些實施 例位于磁性分離裝置中的楔形磁場引導件和平邊磁場引導件之間的多個流道的另一種配 置的圖表。在這些實施例中，所述流道可穿過一對沖壓密封板通過建立和膨脹中空通道而 形成（像以上圖3c中所述的流道）。
[0019] 圖5a是描述了根據本披露的某些實施例位于磁性分離裝置中的楔形磁場引導件 和曲邊磁場引導件之間的多個流道的配置的圖表。圖5b是描述了根據本披露的某些實施 例位于磁性分離裝置中的楔形磁場引導件和曲邊磁場引導件之間的多個流徑的另一種配 置的圖表。在這些實施例中，所述流徑可穿過一對沖壓密封板通過建立和膨脹中空通道而 形成（像以上圖3c和4b中所述的流道）。
[0020] 圖6描述了根據本披露的某些實施例的磁場源和磁場引導件的配置。圖6描述了 各自偶聯到磁場引導件的一對永磁，具有多個楔形物配置。在這些實施例中，一個或多個流 道可位于該多個楔形磁場引導件之間。
[0021] 圖7描述了根據本披露的某些實施例的磁場源和多個磁場引導件的配置。圖7描 述了偶聯到兩個磁場引導件的單個永磁，具有多個楔形物配置。在這些實施例中，一個或多 個流徑可位于該多個楔形磁場引導件之間。
[0022] 圖8,小圖A-D是聲學濃縮器裝置的圖解。小圖A-C :聲學濃縮器裝置流道的側視 圖。微粒開始于沿著通道的側面流動（小圖A)。聲駐波可以被包括在通道中（例如，使用 振動發生器，例如壓電轉換器，將其放置在該通道鄰近處），如由虛線所指示的（小圖B-C)。 聲駐波在通道中心產生了壓力波節（小圖B)。存在于通道中的微粒可以向著壓力波節移動 (小圖C)。小圖D :聲學濃縮器裝置流道的俯視圖。在此實例中，流體流動的方向是從圖的 頂部到底物。該聲學濃縮器包括兩個樣品入口和緩沖液入口。輸入如所圖示的安排，樣品 流體（深灰色）沿著通道的側面流動，其中緩沖液（淺灰色）在之間流動。壓電轉換器位 于通道之下，當其啟動時在通道中產生聲駐波。該聲駐波導致被包含在樣品中的某些微粒 從該通道的側面向著該通道的中心中形成的壓力波節（如通過聚焦區指示的；頂部插入） 移動。通過洗滌的樣品出口對現在被包含在緩沖液中的這些微粒進行收集。置于通道側面 的兩個出口收集廢物。
[0023] 圖9是系統900的圖表，該系統900包括磁性分離裝置920、聲學濃縮器930、和流 式細胞計數器940,用以根據本披露的實施例對液體樣品910進行分選。以約IO 7個細胞/ ml的濃度將磁性試劑添加到液體樣品910中，該液體樣品包含外周血單核細胞（PBMC)。該 液體樣品910流經磁性分離裝置920 (例如，以約200-400 μ Ι/min的流速），其保留該液體 樣品910的細胞，該液體樣品910已用該磁性試劑（例如，紅細胞）標記。退出該磁性分離 裝置的流體因此富集CD4T淋巴細胞（例如，以約2. 5x IO6個細胞/ml的濃度）。這種流體 流經聲學濃縮器930,例如圖8,小圖A-D中所示出的類型的聲學濃縮器。該聲學濃縮器包 含壓電轉換器935 (例如PZT)，該壓電轉換器在被激活時引起該CD4T淋巴細胞向著該通道 的中心形成的壓力波節移動。這個濃縮區是由該中心洗滌的樣品出口收集的，該樣品出口 被流體連接到分選器940,例如BD生物科學Inf lux?細胞分選器。廢物通過該聲學濃縮器 上的兩個出口被去除。相對于流進該聲學濃縮器的流體，該洗滌的樣品915因此富集CD4T 淋巴細胞（例如，以約IO7個細胞/ml的濃度）。使用流式細胞計數器940以適當的流速 (例如，以約40-60 μ L/min的流速）對該洗滌的樣品915進行分選可分離深藍細胞的較小 群體，所述深藍細胞可以是被收集的919。
[0024] 圖10,小圖A-B是根據本披露的實施例包括磁性分離裝置和聲學濃縮器的系統的 機械組分的圖解。
[0025] 圖11-12顯示用以測量本披露的系統的分選效率的軟件的截屏。該BD Influx分 選分析工具被用以比較使用或不使用該主題裝置時流式細胞計數器的分選效率。該軟件被 用以確定觀察到的電子效率（相對于預期的電子效率）。預期的結果基于展現標準泊松分 布的樣品。樣品夾帶一對樣品中的細胞聚集度的測量，定義為所述細胞的所觀察到的分布 與基于標準泊松分布的預期分布的比率一也被計算。展現標準泊松分布的樣品具有1的夾 帶因子，高度聚集的樣品>1，并且優于其的泊松〈1。該軟件也提供了事件率相對于時間的 信息以及相鄰液滴容器（drop bin)中的細胞位置的分析。
[0026] 圖13是用以測量本披露的系統的分選效率的BD Inf Iux分選分析工具軟件的截 屏，顯示對該分選液滴中的細胞的位置的圖形化描述。
[0027] 圖14是用以建立分選條件以及預測分選效率的軟件（BD FACS優化器）的截屏。 該軟件用以預測分選效率，然后將所述分選效率與使用或不使用本披露的裝置而制備的樣 品的觀察到的效率進行比較。
[0028] 圖15是針對樣品的分選液滴中細胞位置的圖形化描述，該樣品不是用本披露的 系統制備的。這個分析是使用該BD Influx分選分析工具進行的。這個樣品展現了高的 夾帶因子（47)，并且可以看到幾個細胞團。所觀察到的電子效率（91.7%)低于期望值 (98. 4% ) 〇
[0029] 圖16是針對樣品的分選液滴中細胞位置的圖形化描述，該樣品是用本披露的系 統制備的。與圖15中所示的樣品相反，該樣品展現低的夾帶因子（0. 02)，并且未看到細胞 團。所觀察到的電子效率（100% )優于期望值（96. 7% )。這個分析是使用該BD Influx 分選分析工具進行的。
[0030] 詳細說明
[0031] 提供了用于對液體樣品中所包含的組分（例如，細胞）進行操縱的裝置。在某些 方面，所述裝置包括磁性分離裝置和流體連接到磁性分離裝置上的聲學濃縮器裝置。本發 明的多個方面進一步包括用于對液體樣品中的細胞進行分選的方法，以及用于實踐該主題 方法的系統和用具包。
[0032] 在更詳細地描述本發明之前，應理解的是本發明不被限制于描述的具體實施例， 因為所述可以改變。還應理解的是，在此使用的術語僅是出于描述具體實施例的目的，并且 不旨在限制，因為本發明的范圍將僅由所附權利要求書限制。
[0033] 在提供了一系列值時，應理解每個中間值，到下限的第十個單位（除非上下文清 晰地另外指示），該范圍的上限與下限之間以及任何其他陳述的或在該范圍內的中間值均 被涵蓋在本發明之內。這些更小范圍的上限和下限可以獨立地被包括在更小范圍之內，并 且也被涵蓋在本發明之內，服從于在所陳述范圍內任何確切排除的限制。在所陳述的范圍 包括一個或兩個限制時，排除了那些被包括的限制的任一個或兩者的范圍也被包括在本發 明之內。
[0034] 除非另外定義，在此所使用的全部技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域之 內的普通技術人員通常所理解的相同的意思。雖然類似于或等同于在此描述的那些的任何 方法和材料也可以用于本發明的實踐或測試中，現在將對代表性說明性方法和材料進行描 述。
[0035] 在本說明書中引用的所有公開物和專利通過引用結合于此，就像每個單獨公開物 或專利被確切地并且單獨地指示為通過引用被結合并且通過引用結合于此，以結合所引用 的所述公開物來披露和描述所述方法和/或材料。任何公開物的引用內容是針對在提交日 之前的披露，并且不能理解為承認因為先前發明而本發明不能獲得比所述公開物更早的申 請日。另外，所提供的公開日期可能與實際公開日期不同，實際公開日期可能需要獨立地確 定。
[0036] 應指出，如在此使用的，并且在所附權利要求書中，單數形式"一個"、"一種"、以及 "該"包括復數指代物，除非上下文另外清晰地指示。另外指出的是，權利要求書可以撰寫以 排除任何可選擇的要素。這樣的陳述意在作為使用與權利要求要素的敘述有關的排他性術 語諸如"單獨"、"僅"等或利用"否定型"限定的前提基礎。
[0037] 如將對于本領域技術人員清楚的是，在閱讀本披露時，在此描述和展示的單獨實 施例的每一個具有離散的組成部分和特征，所述組成部分和特征可以在不偏離本發明的范 圍或精神的情況下易于與任何其他一些實施例的特征分離或組合。可以按照所敘述的事件 的順序或按照邏輯上可行的任何其他順序來進行任何敘述的方法。
[0038] 裝詈
[0039] 如上所述，本披露提供了用于對包含在液體樣品中的多個組分（例如細胞）進行 分選的裝置。在某些方面，所述裝置包括磁性分離裝置和流體連接到磁性分離裝置上的聲 學濃縮器裝置。
[0040] 如在此使用的術語"樣品"、"液體樣品"和"流體樣品"意指包含以任何希望濃度 的在懸浮液中的一種或多種單獨組分的任何樣品。例如，該樣品可以包含IO 11或更少、101° 或更少、IO9或更少、10 8或更少、10 7或更少、10 6或更少、10 5或更少、10 4或更少、10 3或更少、 500或更少、100或更少、10或更少、或一個組分（例如細胞）/毫升。該樣品可以包含已知 數目的組分或未知數目的組分。
[0041] 樣品可展現寬范圍的黏性。液體的粘性可取決于溫度。在某些實施例中，流體樣 品在給定溫度下具有與水實質上相等的粘性（例如，在20°c約lcP，在40°C約0. 65cP)。用 在本披露中的流體樣品可展現寬范圍的粘性，在一些方面范圍從約0.0 lcP至約750cP，包 括約0· IcP至約100cP，例如約0· IcP至50cP、約0· 2cP至約10cP、約0· 2cP至約2. OcP、約 0· 5 至 I. 5cP、或約 0· 75cP 至 I. 5cP。
[0042] 在某些實施例中，該流體樣品包含有機（例如，生物）材料。有機材料可以是生物 或非生物來源。在一些方面，流體樣品可僅包含有機材料。在某些方面中，樣品包含無機材 料。無機材料可以是化學（例如，合成的）來源的。在某些實施例中，樣品包括有機和非有 機材料兩者。
[0043] 在某些方面，該流體樣品包含細胞。合適的細胞包括真核細胞（例如，哺乳動物） 和/或原核細胞（例如，細菌細胞或古細菌細胞）。樣品可以獲得自體外來源（例如，來自培 養生長的實驗室細胞的細胞懸浮液）或獲得自體內來源（例如，哺乳動物受試者、人類受試 者等）。在一些實施例中，該細胞樣品獲得自體外來源。體外來源包括但不限于，原核（例 如，細菌、古細菌）細胞培養物、包含原核和/或真核（例如，哺乳類、原生生物、真菌等）細 胞的環境樣品、真核細胞培養物（例如，建立的細胞系的培養物，已知的或購買的細胞系的 培養物，固定化細胞系的培養物，原代細胞培養物，實驗室酵母菌培養物等）、組織培養物等 等。
[0044] 在一些實施例中，該樣品是獲得自體內來源，并且可以包括獲得自組織（例如，來 自組織活檢的細胞懸浮液，來自組織樣品的細胞懸浮液等）和/或體液（例如，全血、分級 的血液、血漿、血清、唾液、淋巴液、間質液等）的樣品。在一些情況下，在評估之前，對衍生 自受試者的細胞、流體、或組織進行培養、儲存或操縱。體內來源包括活的多細胞生物，并且 可以產生非診斷性或診斷性細胞樣品。
[0045] 在某些實施例中，樣品的來源是"哺乳動物"或"哺乳類"，其中這些術語被廣泛地 用于描述在哺乳綱之內的生物，包括食肉目（例如，狗和貓）、嚙齒目（例如，小鼠、豚鼠、和 大鼠）、以及靈長類（例如，人類，黑猩猩，以及猴子）。在一些情況下，受試者是人類。所述 方法可以應用于獲得自兩性的以及在任何發育階段（即新生兒、嬰兒、幼年、青春期、成年） 的人類受試者的樣品，其中在某些實施例中，人類受試者是幼年、青春期或成年人。盡管本 發明可以應用于來自人類受試者的樣品，但應理解的是，所述方法還可以對來自其他動物 受試者（即，在"非人類受試者"中）的樣品來進行，所述其他動物受試者例如但不限于鳥、 小鼠、大鼠、狗、貓、牲畜以及馬。
[0046] 主題裝置可被配置為用于分析液體樣品的流經裝置。"流經"是指液體樣品可以 穿過入口進入該裝置，被攜帶穿過流徑（例如導管）中的裝置，并且然后通過出口退出該裝 置。該裝置可被配置成攜帶該樣品的連續流穿過該裝置，并隨著該樣品流經該裝置而連續 地分離該樣品中的磁性標記的部分，和/或隨著該樣品流經該裝置的聲學濃縮器部分而基 于該微粒的聲學對比系數（也稱作Φ-系數；下述的）連續地分離微粒（例如，細胞）。該 磁性分離裝置和該聲學濃縮裝置中每個可具有如所希望的1個或更多個入口和出口。例 如，該磁性分離裝置和該聲學濃縮器裝置中每個可單獨包括1個或更多個入口，例如2個或 更多個入口，例如3個或更多個入口，并包括5個或更多個入口。在某些實施例中，該磁性 分離裝置和該聲學濃縮器裝置中每個單獨包括1個和5個之間的入口，例如2個和4個之 間的入口（并包括3個入口）。同樣地，該磁性分離裝置和該聲學濃縮器裝置中每個可單獨 包括1個或更多個出口，例如2個或更多個出口，例如3個或更多個出口（并包括5個或更 多個出口）。在某些實施例中，該磁性分離裝置和該聲學濃縮器裝置中每個單獨包括1個和 5個之間的出口，例如2個和4個之間的出口（并包括3個出口）。
[0047] 該磁性分離裝置和該聲學濃縮器裝置中每個的入口和出口的數量可以相同或不 同。例如，在一種情況下，該主題裝置包括具有1個入口和1個出口的磁性分離裝置，以及 具有3個入口和3個出口的聲學濃縮器裝置。在另一個實施例中，該主題裝置包括具有1 個入口和2個出口的磁性分離裝置，以及具有2個入口和2個出口的聲學濃縮器裝置。
[0048] 所述入口中每個可被配置用以將任何組分引入該主題裝置中，如例如流體樣品、 磁性微粒、試劑、溶劑和緩沖液。當該裝置包括超過一個入口時，每個入口可被用于引入相 同或不同的組分。例如，一個入口可被用于引入流體樣品，而一個或多個替代入口可被用于 引入洗滌緩沖液或鞘液。可手動地（例如，通過注射器或注射器泵）或通過一個或多個注 射器（例如，計算機控制的注射系