一種基于石墨烯量子點的分子信標傳感器及其制備與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種基于石墨烯量子點的多色分子信標傳感 器及其制備與應用。
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著納米科學的發展，納米材料的合成以及在納米尺度上的形貌控制等 方面均取得了傲人的成績。納米技術的出現也給生物學檢測帶來新的發展機遇。納米粒子 作為信號放大的載體被廣泛應用于生物學檢測中。基于納米材料的生物學傳感器的主要優 勢包括以下幾個方面：納米材料本身的小尺寸使得設計成本低、并有可能開發微型化的即 時檢測工具；納米材料直接與檢測環境接觸，加速了信號傳遞，使檢測變得更為快速，同時 也降低了檢測限；納米材料的引入衍生出一些新的檢測手段，如仿生、無試劑傳感及低毒、 高穩定性體內檢測等。許多納米材料，如金納米顆粒和碳納米材料6 (碳納米管、石墨稀及 其衍生物等）因其因其良好的穩定性和生物相容性，被廣泛用作載體或示蹤物、催化劑、導 電基體、光發射器等，在生物學檢測中起到信號放大及穩定識別探針的作用。
[0003] 石墨稀量子點（graphene quantum dots，GQDs)是一種新興的零維納米材料，它同 時具有石墨烯和碳量子點的特性，與傳統的有機染料分子和半導體量子點相比，石墨烯量 子點有更高的光學穩定性，抗光漂白性以及低毒及優異的生物相容性。和碳量子點相比，石 墨烯量子點還保留著石墨烯的片層結構，這樣就使得它具有和石墨烯及其氧化物類似的優 異性質，如良好的導電性、機械性能及優異的水溶性等。
[0004] 近年來，石墨烯量子點在檢測領域得到廣泛關注，由于它本身具有優異的電子學 及光學性質，基于石墨烯量子點的傳感器具有很好的檢測性能。其中應用最廣泛的就是基 于石墨烯量子點的光學傳感器，它主要是利用石墨烯量子點本身發光性質進行檢測一種方 法，這種方法主要采用的是石墨烯量子點的熒光被猝滅（Signal-OfT)或者淬滅后又得到 恢復（signal-on)的策略。Jinet等人于2012年首先開發了一種基于石墨稀量子點的光學 傳感器，他們發現Fe3+吸附到石墨烯量子點上后可以通過電荷轉移作用淬滅其熒光，于是 就開發了一種簡便、綠色的檢測鐵離子的傳感器。之后，又涌現出了很多基于此原理的傳感 器，用于檢測銀離子、氯氣、葡萄糖等。生物傳感器方面已有科學家研宄了基于石墨烯量子 點的電子存儲器、生物傳感器，開發它在生物及體內成像等方面的應用。然而，由于石墨烯 量子點本身的小尺寸及電負性，使得核酸小分子DNA、miRNA等不易與其結合，進而限制了 它在核酸檢測方面的應用。
[0005] 目前檢測核酸小分子（如DNA，miRNA，mRNA等）的方法主要有Northern blotting,微芯片（microarray)和實時焚光定量 PCR (RT-PCR)等。Northern blotting 方 法通過聚丙烯酰胺變性凝膠電泳對RNA樣品按大小與分子量進行分離，然后將RNA轉移并 固定在膜上，再與標記好的DNA探針雜交，再將非特異性結合的探針洗掉，最后經過顯影獲 得信號。此方法雖然是經典方法，但其靈敏度、特異性不高，操作步驟多且復雜，樣品需要量 大、耗時長。microarray技術雖然有高通量的優勢，但是會受到標志物家族類似序列交叉 雜交的干擾，使得其靈敏度及特異性不高，并且測試范圍較窄，需要昂貴的儀器設備；相比 較而言，RT-PCR技術具有較高的靈敏度和實用性，但由于miRNA自身的限制對引物的設計 要求很高且溫度難以控制，這就限制了該方法的應用。針對這些難點，研宄人員提出了許多 新的策略，類似于RT-PCR的滾環放大技術（RCA)作為一種等溫擴增技術很好的解決了核酸 溫度難以控制的問題，提高了檢測靈敏度但同時也存在操作繁瑣批次間差異大等問題，限 制了該方法的進一步發展。還有一些研宄人員采用生物發光，表面增強拉曼，原位雜交，DNA 納米結構、納米孔傳感等技術來檢測核酸分子，但是這些方法要么需要昂貴的儀器設備，要 么成本比較高。總體來講，核酸分子的檢測仍然需要進一步發展，目前存在的方法在中要么 需要很多步驟，要么需要昂貴的試劑，要么需要復雜的儀器。因此，發展簡單、快速、廉價的 腫瘤標志物核酸分子檢測方法勢在必行，同時又要提高檢測的靈敏度和特異性。
【發明內容】
[0006] 鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種基于石墨烯量子點的 分子信標傳感器及其制備與應用。
[0007] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0008] 本發明的第一方面提供了一種基于石墨烯量子點的分子信標傳感器，包括依次排 布的石墨烯量子點、第一信標莖干區、環狀區、第二信標莖干區和熒光基團，所述環狀區為 與待測目標分子特異結合的核苷酸片段，所述第一信標莖干區的核苷酸序列與第二信標莖 干區的核苷酸序列互補。
[0009] 優選地，所述石墨稀量子點通過Pyrene與第一信標莖干區連接。
[0010] Pyrene，亦即，芘，其CAS登錄號為129-00-0,分子式為(：16氏。。
[0011] 優選地，所述環狀區為含有15~30堿基的核苷酸片段。所述環狀區能與待測目 標分子特異結合，所述環狀區可以根據待測目標分子的核苷酸序列來設計。
[0012] 在本發明的優選實施方式中，所述環狀區的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或2所示。 具體為：
[0013] 5，-ACCCC TATCA CGATT AGCAT TAA-3' SEQ ID NO. 1 ;
[0014] 5' -CAGTG TGCGG TGGGC AGGGG CT-3< SEQ ID NO. 2。
[0015] 優選地，所述第一信標莖干區和第二信標莖干區均為含有5~8個堿基的核苷酸 片段。
[0016] 所述第一信標莖干區的核苷酸序列與第二信標莖干區的核苷酸序列互補。
[0017] 更優選地，所述第一信標莖干區的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，具體為： 5， -CGCTGC-3' 〇
[0018] 優選地，所述熒光基團的激發波長與所述石墨烯量子點的發射波長有部分重疊。 更優選地，所述熒光基團選自Cy5Cy3或FAM。
[0019] 自由狀態時，分子信標傳感器的兩個末端靠近，使熒光基團與石墨烯量子點靠近， 此時發生熒光共振能量轉移效應。當分子信標與序列完全互補的目標分子結合形成雙鏈雜 交體時，兩個信標莖桿互補區被拉開，熒光基團和石墨烯量子點距離增大，熒光共振能量轉 移效應減弱甚至消失。從而根據熒光強度變化來檢測目標分子的含量。
[0020] 本發明的第二方面還提供了一種制備前述基于石墨烯量子點的分子信標傳感器 的方法，所述方法包括步驟：將由依次首尾連接的Pyrene、第一信標莖干區、環狀區、第二 信標莖干區和熒光基團組成的熒光探針與石墨烯量子點混合，即可獲得基于石墨烯量子點 的分子信標傳感器。
[0021] 優選地，所述石墨稀量子點的濃度為I. 0 μ g/mL。
[0022] 優選地，所述熒光探針的濃度為50~400 μ Μ。更優選為300 μ Μ。
[0023] 所述石墨烯量子點為現有技術，既可以參考現有的文獻制備，也可以通過商業途 徑購買。
[0024] 本發明的第三方面公開了一種非疾病診斷目的的檢測目標分子的方法，包括如下 步驟：先將待測目標分子和前述基于石墨烯的分子信標傳感器混合，再進行熒光值檢測。
[0025] 優選地，所述目標分子包括DNA、miRNA、mRNA。
[0026] 優選地，所述前述基于石墨烯量子點的分子信標傳感器如上所述。
[0027] 本發明第四方面還提供了前述基于石墨烯量子點的分子信標傳感器在制備DNA、 miRNA或mRNA檢測試劑盒中的用途。
[0028] 本發明第五方面，提供了一種試劑盒，包括前述基于石墨烯量子點的分子信標。
[0029] 本發明檢測原理如圖1所示：
[0030] 利用石墨烯量子點納米材料本身優異的光學性質，以熒光染料標記的分子信標作 為探針，通過熒光共振能量轉移現象（FRET)對于距離的敏感性來檢測DNA、mRNA或miRNA， 并且可以設計標記不同熒光分子的分子信標傳感器，實現多種目標分子的同時檢測。具體 來說，一端修飾熒光染料，另一端修飾Pyrene小分子的熒光探針可以和石墨烯量子點通過 π - π作用相互吸附在一起。通過對熒光染料分子的合理選擇，石墨烯量子點和熒光分子之 間可以發生有效的FRET現象，石墨烯量子點的能量可以部分轉移給熒光分子，使得熒光分 子發出焚光。而當加入我們的待測革E標分子DNA、mRNA或miRNA后，革E標分子與分子信標的 識別序列雜交，可以將分子信標探針的莖環結構打開，形成雙鏈結構，導致熒光分子和石墨 烯量子點的距離變遠，FRET現象減弱甚至消失。根據FRET效率引發的熒光強度的變化，我 們可以方便快捷的檢測目標分子，并且通過選擇不同發射波長的熒光染料，以及其分子信 標的環狀區域設計不同的識別序列，實現多種目標分子（DNA，mRNA或miRNA)的同時檢測。
[0031] 本發明的有益效果為：
[0032] (1)本發明首次將石墨烯量子點應用于構建分子信標傳感器，用于小分子核酸 DNA