抗性基因
[0027]I，利用CTAB法提取番茄基因組DNA
[0028]待鑒定材料為以下品種的番茄材料:申粉8號、申粉918、浦紅9號、浦紅10號、申粉V-1、東農721、先正紅珠。
[0029]采集上述品種番茄材料的新葉，用CTAB法提取DNA，具體提取方法如下:
[0030](I)取l_50g新鮮植物材料，于液氮中研成粉。(2)將凍粉轉入預冷的離心管中，立即加入等體積(w/v) 2 X CTAB提取緩沖液，65°C保溫10-20分鐘，其間不時搖動。(3)加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒離心管混勻，室溫下，12000r/min離心10-20分鐘。(4)將上清液轉入另一離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，顛倒離心管混勻，室溫、12000r/min離心10分鐘。(5)將上層水相轉入新的經硅烷化處理的離心管中，加入0.6-1倍體積的異丙醇，混勻，室溫下放置30分鐘。(6) 3500-4000r/min離心5-10分鐘，去上清液，70%乙醇漂洗，沉淀吹干。(7)風干后加入40ul的TE緩沖液溶解DNA，-20°C保存備用。
[0031]2，用分子標記引物對番茄DNA進行PCR擴增
[0032]用篩選的分子標記引物對前述提取的番茄基因組DNA進行PCR擴增，所述分子標記引物的正向引物序列為5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)，所述分子標記引物的反向引物序列為5’ -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3’ (其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示)ο
[0033]PCR的反應體系是:10ng/uL的模板DNA 3 μ L，10umol/L的正向引物2.5 μ L，10umol/L 的反向引物 2.5 yL，10mmol/L 的 dNTP 0.625 μ L，10XPCR buffer 2.5 μ L，1mmoI/L 的 Mg2+2.5ul，Taq 酶 1U，補充 ddH20 至 25 μ L ;
[0034]PCR程序分別為:94 °C預變性3min，然后94°C變性30s，退火溫度57 °C 60s，72°C 60s，進行35個循環，最后72°C延伸1min。
[0035]3，對PCR擴增產物進行電泳分析
[0036]將前述PCR擴增產物于2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳。參見圖1，該圖為本發明中的分子標記引物對待檢測番茄材料進行PCR擴增后產物的電泳圖。圖1中M代表的泳道為TaKaRa DL1000DNA Marker ；1代表的泳道為空白對照H2O ；2代表的泳道為申粉8號的番茄材料；3代表的泳道為申粉918的番茄材料；4代表的泳道為浦紅9號的番茄材料；5代表的泳道為浦紅10號的番茄材料；6代表的泳道為申粉V-1的番茄材料；7代表的泳道為東農721的番茄材料；8代表的泳道為先正紅珠的番茄材料。其中泳道6出現690bp條帶，表明對應的番茄材料申粉V-1為抗病番茄品種；其它泳道均出現409bp的條帶，表明其它番茄材料均為不抗病番茄品種。
[0037]上述僅為本發明的部分優選實施例，本發明并不僅限于實施例的內容。對于本領域中的技術人員來說，在本發明技術方案的構思范圍內可以有各種變化和更改，所作的任何變化和更改，均在本發明保護范圍之內。
【主權項】
1.一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標記方法，該方法包括如下步驟: 步驟I，提取番茄的基因組DNA ； 步驟2，用分子標記引物對前述提取的番茄基因組DNA進行PCR擴增，所述分子標記引物的正向引物序列為5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’，所述分子標記引物的反向引物序列為 5， -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3，； 步驟3，對前述PCR擴增產物進行電泳分析，如果電泳圖中產生690bp的條帶，則表明植株中含有黃化曲葉病毒抗性基因Ty-Ι，為抗病植株；如果電泳圖中產生409bp的條帶，則表明植株為含ty-Ι基因位點的株系，為不抗病植株。
2.如權利要求1所述的鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標記方法，其特征在于:所述步驟3中PCR擴增產物的電泳圖中如果同時產生690bp和409bp的條帶，表明植株為含Ty-1/ty-l位點的株系，為雜抗植株。
3.如權利要求1所述的鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標記方法，其特征在于，所述步驟2中PCR擴增的反應條件如下: PCR的反應體系是:10ng/uL的模板DNA 3yL，10umol/L的正向引物2.5 μ L，1umol/L 的反向引物 2.5 yL，10mmol/L 的 dNTP 0.625 μ L，1XPCR buffer2.5 μ L，10mmol/L 的Mg2+2.5ul，Taq 酶 IU，補充 ddH20 至 25 μ L ; PCR程序分別為:94°C預變性3min，然后94°C變性30s，退火溫度57°C 60s, 72°C 60s，進行35個循環，最后72°C延伸1min。
4.一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標記引物，其特征在于:該引物的正向引物序列為5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’，反向引物序列為5， -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3，。
5.權利要求4所述的分子標記引物在番茄黃化曲葉病毒抗性基因定位、檢測或標記輔助育種中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標記方法。該方法為：提取番茄的基因組DNA；用分子標記引物對前述提取的番茄基因組DNA進行PCR擴增，對前述PCR擴增產物進行電泳分析，如果電泳圖中產生690bp的條帶，則表明植株中含有黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1，為抗病植株；如果電泳圖中產生409bp的條帶，則表明植株為含ty-1基因位點的株系，為不抗病植株。本發明標記方法中的電泳圖帶型簡單，易于鑒別，可直接應用于標記輔助選擇，節省了時間、物力、人力，且提高鑒定的準確性。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104726602
【申請號】CN201510160949
【發明人】劉士輝, 張輝, 朱為民, 姚永康, 馬新海, 金靜, 孫洪助, 閻君, 劉娜, 于力, 楊學東
【申請人】上海孫橋現代農業聯合發展有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年4月7日