鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標記方法
【技術領域】
[0001]本發明農業生物技術領域，具體涉及一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標記方法。
【背景技術】
[0002]番前黃化曲葉病毒病為中國番前黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curlvirus，TYLCV)，屬于雙生病毒科。番前黃化曲葉病毒病與蔬菜上常見其它病毒病(如花葉、厥葉、條斑等病毒病)相比較而言，具有暴發突然、擴展迅速、危害性強、治療難度大等特點，是目前番茄生產上一種毀滅性的植物病害，是一種嚴重威脅全世界番茄生產的病害。培育抗病品種已成為防治該病害的主要技術手段。
[0003]標記輔助選擇是育種的重要組成部分，加快了培育番茄雜交種的育種進程。分子標記技術已經被廣泛應用于番茄抗病基因的定位，關于番茄抗雙生病毒的分子標記的開發國外取得了很大進展。Zamir等將感病系M82 -1 - 8作為母本與抗TYLCV的智利番茄LA1969雜交，分析后代RFLP標記和抗性，把耐TYLCV的不完全顯性的主效基因Ty-1基因定位在6號染色體的標記TG297 (4cM)和TG97 (8.6cM)附近。Ji和Scott利用感病品種‘Horizon’和抗病材料(智利番茄)雜交后的F3分離群體進行RAH)進行分析，找到了與抗TYLCV基因緊密連鎖的2個RAPD標記UBC697和UBC264，并將其轉化為SCAR標記。可用于標記Ty-1基因還有CAPS標記。但以上標記存在的問題是操作流程較多，有些需要酶切等，此外與標記基因的連鎖程度不高。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是，提供一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標記方法。旨在解決現有技術中番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的標記操作流程較多、需要酶切、與標記基因連鎖程度不高的技術問題。
[0005]本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案如下:
[0006]一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標記方法，該方法包括如下步驟:
[0007]步驟I，提取番茄的基因組DNA ；
[0008]步驟2，用分子標記引物對前述提取的番茄基因組DNA進行PCR擴增，所述分子標記引物的正向引物序列為5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)，所述分子標記引物的反向引物序列為5’ -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3’ (其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示)；
[0009]步驟3，對前述PCR擴增產物進行電泳分析，如果電泳圖中產生690bp的條帶，則表明植株中含有黃化曲葉病毒抗性基因Ty-Ι，為抗病植株；如果電泳圖中產生409bp的條帶，則表明植株為含ty-Ι基因位點的株系，為不抗病植株。
[0010]進一步地，所述步驟3中PCR擴增產物的電泳圖中如果同時產生690bp和409bp的條帶，表明植株為含Ty-1/ty-l位點的株系，為雜抗植株。
[0011]進一步地，所述步驟2中PCR擴增的反應條件如下:
[0012]PCR的反應體系是:10ng/uL的模板DNA 3 μ L，10umol/L的正向引物2.5 μ L，10umol/L 的反向引物 2.5 yL，10mmol/L 的 dNTP 0.625 μ L，10XPCR buffer 2.5 μ L，1mmoI/L 的 Mg2+2.5ul，Taq 酶 1U，補充 ddH20 至 25 μ L ;
[0013]PCR程序分別為:94 °C預變性3min，然后94°C變性30s，退火溫度57 °C 60s，72°C 60s，進行35個循環，最后72°C延伸1min。
[0014]本發明還提供了一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1的分子標記引物，其特征在于:該引物的正向引物序列為5’-CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’ (其核苷酸序列如SEQID N0.1所示)，反向引物序列為5’ -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3’ (其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示)ο
[0015]本發明還提供了上述的分子標記引物在番茄黃化曲葉病毒抗性基因定位、檢測或標記輔助育種中的應用。
[0016]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0017](I)由于番茄黃化曲葉病毒為煙粉虱傳播，傳統田間鑒定方法需要的且對條件要求苛刻。本發明提供的標記方法則省去了田間鑒定所需要的長周期及對條件要求的苛刻。
[0018](2)本發明標記方法中的電泳圖帶型簡單，易于鑒別，可直接應用于標記輔助選擇，節省了時間、物力、人力，且提高鑒定的準確性。將該標記應用于苗期育種選擇，能夠準確的篩選出具有抗病基因的個體植株，從而加速育種進程。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發明中的分子標記引物對待檢測番茄材料進行PCR擴增后產物的電泳圖。
【具體實施方式】
[0020]下面結合實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。以下采用的試劑和生物材料如未特別說明，均為商業化產品。
[0021]實施例1，分子標記引物的篩選
[0022]采用BSA法分別構建抗病基因池和感病基因池，用于分子標記引物的篩選。
[0023]Zamir等將黃化曲葉病毒抗性基因Ty-1定位在6號染色體上，與該基因連鎖的RAPD標記及CAPS標記均已被篩選出。本發明根據該定位結果以及番茄基因組序列和SSR遺傳圖譜，新設計一系列標記引物。然后針對設計的一系列標記引物對抗病材料和不抗病材料進行多態性篩選。篩選結果只有一對引物能夠擴增出多態性，可作為分子標記引物。該分子標記引物在含Ty-1位點的抗病材料中能夠擴增出690bp的片段；在含ty-Ι位點的不抗病材料中則擴增出409bp的片段；對于含Ty-1/ty-l位點的雜抗植株，則同時產生690bp和409bp的片段。
[0024]進一步，通過構建的抗病基因池和感病基因池對篩選的分子標記引物進行穩定性鑒定，確定該分子標記引物擴增的多態性穩定。
[0025]篩選獲得的分子標記引物為:正向引物序列為5’ -CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT-3’ (其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)，反向引物序列為5’ -CAACGGAGGGAGCATATCAT-3’ (其核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0026]實施例2，利用篩選的分子標記引物鑒定黃化曲葉病毒