一種與大豆抗疫霉病相關的microRNA的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種與大豆抗疫霉病相關的microRNA，屬于大豆分子生物學領域。
【背景技術】
[0002] 大豆是一種重要農作物，富含蛋白質和脂肪以及對人體有利的活性成分如皂貳、 異黃酮、磷脂等，是世界上植物性蛋白和油分的主要來源之一。目前我國大豆種植面積、總 產及單產均居世界第四位，生產水平落后于世界大豆生產。2012年中國大豆種植面積718 萬公頃，總產量1280萬噸，而進口大豆達到創記錄的5750萬噸，占據我國五分之四的大豆 市場。造成我國大豆生產滯后、供給嚴重不足、國內大豆產業遭受進口轉基因大豆嚴重沖 擊的原因是多方面的，但主要原因之一是綜合抗病蟲害和抗逆能力差，單產低，種植效益低 下，國際競爭力弱。控制大豆合適的百粒重是實現大豆高產的有效辦法。但是，目前對可以 用于大豆育種過程中父母本篩選的標記位點的報道較少，對于實現在育種前期對親本或者 雜交后代的百粒重遺傳背景進行選擇的手段和方法還比較有限。
[0003] 通過對大豆抗病品種的篩選與鑒定，近些年在中國發現了許多抗病品種。由于新 的毒力小種的出現和長期使用單一抗性品種，這些含有主效抗病基因的品種通常抗病有效 時間為8至15年。利用含有Rps抗病基因的栽培品種雖然能有效的控制大豆疫霉根腐病 的發生。但是隨著該品種種植年份的增長，新的生理小種不斷出現，原有的抗病品種會逐漸 喪失抗性。近年來發現，miRNA為重要的轉錄后調控因子，通過降解或抑制mRNA從而達到 負調控效果。由于miRNA在植物體中的這一重要角色，基于miRNA對植物抗病、耐性、生理 等方面的研宄日益增多。
【發明內容】
[0004] 本發明首先提供了一種與大豆抗疫霉病相關的microRNA :gma-miR482c-3p，其核 苷酸序列為：UUCCCAAUUCCGCCCAUUCCU。該microRNA所調控的靶基因 Glyma08g42971的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 所述gma-miR482c-3p與產生特異監測蛋白的過程相關，涉及植物-病原 互作（Plant-pathogen interaction)通路中的應答層面：Effector-triggered immunity(ETI)。ETI是通過產生特異的細胞內監測蛋白監測病原菌產生的毒力蛋白，從而 達到對病原菌的高靈敏度的應答。
[0006] 所述miRNA分子gma-miR482c_3p通過抑制或者降解的方式調控祀基因 Glyma08g42971。
[0007] 本發明還提供了一種獲得gma-miR482c_3p的方法，一方面，通過比較疫霉根腐病 感染樣品與正常樣品的差異表達基因，結合軟件預測結果、數據庫注釋信息，取交集，并進 一步通過實時定量PCR確認microRNA及其靶基因與大豆抗疫霉根腐病的關系；另一方面， 對篩選預測得到的miRNA-靶基因關系進行歸納分類，并對分類結果的信息進行歸納分析， 獲得與植物體積極適應環境相關的通路的基因，進一步確認microRNA與大豆抗疫霉根腐 病相關。
[0008] 本發明所述的microRNA小分子gma-miR482c_3p的革El基因在接種疫霉根腐病菌 后的轉錄組數據中，不同時間段內具有明顯變化，這一表達特性被基于莖環法的實時定 量PCR實驗所驗證，基于莖環法的實時定量PCR同時證實了 gma-miR482c-3p與其靶基因 Glyma08g42971的調控關系。本發明還通過生物信息學手段對該miRNA小分子的功能進行 了分析，進一步證實了其與抗大豆疫霉根腐病相關。
[0009] 本發明通過比較疫霉根腐病感染樣品與正常樣品的差異表達基因，結合軟件預測 結果、數據庫注釋信息，初步獲得候選mi CroRNA及其靶基因，并進一步通過實時定量PCR確 認microRNA及其革El基因與大豆抗疫霉根腐病的關系。同時還對miRNA-革El基因關系進行聚 類分析，并對聚類分析結果進行了注釋及代謝通路研宄，進一步證實gma-miR482c-3p與抗 大豆疫霉根腐病相關。miRNA的抗病機制是通過作用于mRNA從而抑制或降解mRNA，從而達 到抗病效果的。目前已經有大量的研宄是針對大豆抗疫霉根腐病的基因，而對大豆抗疫霉 根腐病的miRNA研宄鮮有報道。而抗病miRNA的提出，更是為抗病機制的研宄提供了一種 新的途徑。而gma-miR482c-3p對疫霉根腐病抗性的證明，為后續的研宄奠定了基礎，使后 續的研宄更為便捷。
【附圖說明】
[0010] 圖1為miRNA-target關系預測韋恩圖。
[0011] 圖2為6個時間段內，不同樣品中gma-miR482c-3p、Glyma08g42971的表達量； CK :為不做任何處理的樣品，M :為不接種疫霉根腐病菌的樣品，T :為接種疫霉根腐病菌的 樣品。
[0012] 圖3為3個時間段內miRNA與其預測靶基因的變化趨勢圖
[0013] 圖4為接種位置及方法圖示
[0014] 圖5為miRNA與植物-病原互作通路中功能位置標注。
【具體實施方式】
[0015] 在以下的實施方案中，除非特別說明，否則所有操作均按照《分子克隆實驗指南》 (第三版）（黃培堂等譯，北京：科學出版社，2002)所提供的方法進行。
[0016] 實施例1預測篩選抗病gma-miR482c_3p
[0017] (1)篩選大豆中與抗疫霉根腐病相關的基因
[0018] 對侵染疫霉根腐病菌1號生理小種的綏農10號大豆品種進行表達譜測序。采 用了侵染相同疫霉根腐病菌1號生理小種的SCKL，SML，STL0. 5, STL2和STL4這5個樣 品，用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit分別提取了總RNA作為測序樣品，樣品的表達譜 測序由華大基因完成。其中，SCKL為不做任何處理的樣品，SML為不接種疫霉根腐病菌 的樣品，STL0. 5、STL2、STL4為接種疫霉根腐病菌后分別于0. 5h、2h、4h取樣的樣品。接 種位置及方法如圖4所示，在SCKL，SML，STL0. 5, STL2, STL4這5個樣品的表達譜測 序數據中，一共檢測到33683個拼接序列片段。采用算法l〇g2Rati 〇(RPKM(Sample2)/ RPKM(samplel))對樣品間具有表達量變化的序列片段進行了篩選，得到差異表達基因，當 log2Ratio(RPKM(sample2)/RPKM(samplel)) |>1時，說明該基因在樣品1與樣品2之間為 差異表達基因。經過上述方法的篩選，得到較為可靠的7401個受疫霉根腐病影響，發生表 達量變化的基因。
[0019] 其中，測序結果由RPKM表示基因的表達量，RPKM計算公式為：
【主權項】
1. 一種與大豆抗疫霉病相關的microRNA:gma-miR482c-3p，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
2. -種權利要求1所述microRNA調控的靶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
3. -種獲得權利要求1所述microRNA的方法，其特征在于，通過比較疫霉根腐病感染 樣品與正常樣品的差異表達基因，結合軟件預測結果、數據庫注釋信息，取交集，獲得候選 microRNA及其靶基因，并進一步通過實時定量PCR確認microRNA及其靶基因與大豆抗疫霉 根腐病的關系。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，對候選的miRNA-靶基因關系進行生物信 息學的聚類分析，獲得與植物體積極適應環境相關的通路的基因，進一步確認microRNA與 大豆抗疫霉根腐病相關。
5. 權利要求1所述的miRNA分子在調控靶基因Glyma08g42971中的應用。
6. 權利要求1所述的miRNA分子在大豆抗疫霉根腐病中的應用。
7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述miRNA分子gma-miR482c-3p通過抑 制或者降解的方式調控靶基因Glyma08g42971的表達，達到抗疫霉根腐病的效果。
8. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述miRNA分子gma-miR482c-3p涉及植 物-病原互作通路中的應答層面，所述植物-病原互作通路中的應答層面是通過產生特異 的細胞內監測蛋白監測病原菌產生的毒力蛋白，從而達到對病原菌的高靈敏度的應答。
【專利摘要】本發明公開了一種與大豆抗疫霉病相關的microRNA，屬于大豆分子生物學領域。本發明通過與已知抗病免疫相關基因的篩選得到抗疫霉病基因223個，miRNA256個。利用表達譜測序、嚴謹的生物信息學分析以及實時定量PCR檢測建立了與抗病相關miRNA-Target預測系統，可預測miRNA的功能，大大提高了大豆抗疫霉病基因以及miRNA的篩選鑒定效率。本發明提供了對MIRNA-target關系進行分類的方法，發現了通路Plant-pathogen interaction在對疫霉菌的防御中起到十分關鍵的作用。并證實了gma-miR482c-3p是通路Plant-pathogen interaction中的主要成分并與大豆對疫霉根腐病的抗病緊密相關。
【IPC分類】A01P3-00, C12N15-10, A01N57-16, C12N15-31, C12N15-113
【公開號】CN104726457
【申請號】CN201510166506
【發明人】朱榮勝, 陳慶山, 辛大偉, 劉春燕, 胡振幫, 蔣洪蔚, 齊照明, 韓雪, 王志豪
【申請人】東北農業大學
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年4月9日