一種高效提取肝素鈉的生產工藝的制作方法
【專利說明】
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技術領域
[0001]本發明涉及一種高效提取肝素鈉的方法，具體涉及一種利用酶法與膜分離技術和沉淀技術有效結合，從而高效提取肝素鈉的生產工藝。
(二)
【背景技術】
[0002]肝素是一種由D-葡糖胺、D-葡糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺和L-艾杜糖醛酸多種糖類組成的酸性黏多糖，廣泛存在于哺乳動物腸黏膜、心臟、肝臟、肺、血液、胰腺和胎盤等組織中。具有良好的抗凝血、降血脂、促纖維蛋白溶解、抗中膜平滑肌細胞增殖等方面的活性，被廣泛用于心腦血管疾病的治療。肝素鈉是肝素的鈉鹽形式，在肝素提取過程中將其以鈉鹽的形式制備，便于藥效和活性的保存，同時可作為藥物制劑使用。目前，肝素鈉的工廠規模化生產多以豬、羊、牛的小腸黏膜及牛肺等為原料，采用鹽解-樹脂吸附/洗脫-乙醇沉淀的工藝方法進行。而這種工藝生產出的肝素鈉產率低、效價低，且肝素鈉精品的獲得還需經過復雜的氧化、純化等工藝過程，工作繁瑣、成本居高。
(三)
【發明內容】
[0003]本發明的目的提供一種酶解-樹脂吸附/洗脫-膜分離-乙醇沉淀-干燥的生產工藝方法，通過酶法與膜分離技術和沉淀技術的有效結合，改善肝素鈉提取工藝，獲得高效價的肝素鈉精品。
[0004]如上構思，本發明的技術方案是:一種高效提取肝素鈉的生產工藝，其特征在于:包括如下步驟:
[0005]①腸黏膜酶解:將收集的腸黏膜加水稀釋至波美度為8-9，調節pH至8.0-10.0，加熱煮沸變性10-20min，待溫度降至50_55°C時，酶解，酶解液離心后，收集上清液；
[0006]②樹脂吸附:調節上清液pH至9-9.5，濃度調節至波美度為8-9，加入6%樹脂，于室溫下攪拌吸附10_12h ；
[0007]③樹脂洗滌與洗脫:吸附完成后，靜置20_40min，吸去上層液體，然后漂洗樹脂，最后攪拌洗脫樹脂2次，每次時間4-5h，將兩次洗脫液合并；
[0008]④膜分離:將步驟④洗脫液邊攪拌邊用PAN膜濃縮，濾速為30-40mL/min，至膜上部分占總體積的10-15%時，停止濃縮過程，收集膜上殘留部分；
[0009]⑤乙醇沉淀:將步驟⑤收集物中邊攪拌邊加入1.5倍體積的95%乙醇，密封靜置過夜，使之充分沉淀，除去上層乙醇溶液；再分別用2倍體積的95%乙醇和無水乙醇各沉淀一次，收集沉淀，將所得沉淀于真空干燥箱中真空干燥，即得分離純化的肝素鈉。
[0010]上述步驟①的酶解條件是:加入l%(m/v)蛋白復合酶酶解，收集上清液；酶解保溫2h ;離心的條件是:酶解液于4°C、4000r/min離心15min。
[0011 ] 上述步驟②的樹脂采用6%D254型樹脂。
[0012]上述步驟②攪拌速度為50_60r/min
[0013]上述步驟③用分別用蒸餾水和1.2mol/L氯化鈉漂洗樹脂，加入I倍樹脂體積的4mol/L氯化鈉溶液洗脫。
[0014]上述PAN膜截留分子量為3000-4000。
[0015]上述蛋白復合酶為包含胃蛋白酶和胰蛋白酶的商用復合酶。
[0016]本技術方案與傳統工藝相比優點在于:
[0017]酶法與膜分離技術和沉淀技術的有效結合，可以有效提高所提取肝素鈉的效價至160U/mg,比傳統的鹽解-離子交換-乙醇沉淀法提高近64%，最后回收率提高29%。
[0018]第1，本技術方案中，高溫的堿性環境，可以使與肝素結合在一起的蛋白分子充分變性，酶解可以促使蛋白分子進一步變為小分子的多肽，因而更容易與肝素分離，同時，酶解溫度為50-55°C，溫和的酶解環境，可以保證蛋白酶的高活性，又有效保護肝素鈉較少受蛋白酶的破壞，保持肝素鈉產物的效價。
[0019]第2，本技術方案中，酶解液先經過樹脂吸附分離過程，可以將分子量大于肝素分子的蛋白、核酸、色素等其它雜質有效去除，減少下一步膜分離的負荷。
[0020]第3,本技術方案中，膜分尚所用PAN膜截留分子量為3000-4000,可以將分子量大于肝素分子的小分子雜質有效去除，同時保證肝素鈉產物的效價。
[0021]第4，本技術方案中，膜分離的截留量保持在總體積15%左右，可以使大部分的小分子蛋白質、核酸及其他一些雜質被有效去除，又不使肝素鈉效價丟失。
(四)
【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例對本發明做進一步說明:
[0023]一種高效提取肝素鈉的生產工藝，包括如下步驟:
[0024]1、材料預處理
[0025]新鮮豬小腸沖洗干凈，剪開，用刀片刮取腸黏膜，收集至自封袋中，4°C保存備用。
[0026]2、酶解
[0027]將步驟I中收集的腸黏膜50kg加水稀釋至波美度為8_9(波美計測量，4mol/L氯化鈉調節濃度)，調節PH至8.0-10.0,加熱煮沸變性15min，待溫度降至50_55°C左右時，力口入l%(m/v)蛋白復合酶，酶解保溫2h，酶解液于4°C、4000r/min離心15min，收集上清液。
[0028]3、樹脂吸附
[0029]調節上清液pH至9-9.5，濃度調節至波美度為8_9 (波美計測量，4mol/L氯化鈉調節濃度)，加入6%D254型樹脂，于室溫下攪拌吸附10-12h，攪拌速度為50_60r/min。
[0030]4、樹脂洗滌與洗脫
[0031]吸附完成后，靜置30min，虹吸吸去上層液體，分別用蒸餾水和1.2mol/L氯化鈉漂洗樹脂。然后加入I倍樹脂體積的4mol/L氯化鈉溶液，攪拌洗脫2次，每次時間5h，將兩次洗脫液合并。
[0032]5、膜分離
[0033]將步驟4洗脫液邊攪拌邊用PAN膜(Mr3000-4000)濃縮，濾速為30-40mL/min，至膜上部分占總體積的15%左右時，停止濃縮過程，收集膜上殘留部分。
[0034]6、乙醇沉淀
[0035]將步驟5收集物中邊攪拌邊加入1.5倍體積的95%乙醇，密封靜置過夜，使之充分沉淀，采用虹吸法除去上層乙醇溶液。再分別用2倍體積的95%乙醇和無水乙醇各沉淀一次，收集沉淀。將所得沉淀于真空干燥箱中真空干燥8h，即得分離純化的肝素鈉15kg。
【主權項】
1.一種高效提取肝素鈉的生產工藝，其特征在于:包括如下步驟: ①腸黏膜酶解:將收集的腸黏膜加水稀釋至波美度為8-9，調節pH至8.0-10.0，加熱煮沸變性10-20min，待溫度降至50_55°C時，酶解，酶解液離心后，收集上清液； ②樹脂吸附:調節上清液PH至9-9.5，濃度調節至波美度為8-9，加入樹脂，于室溫下攪拌吸附10-12h ； ③樹脂洗滌與洗脫:吸附完成后，靜置20-40min，吸去上層液體，然后漂洗樹脂，最后攪拌洗脫樹脂2次，每次時間4-5h，將兩次洗脫液合并； ④膜分離:將步驟④洗脫液邊攪拌邊用PAN膜濃縮，濾速為30-40mL/min，至膜上部分占總體積的10-15%時，停止濃縮過程，收集膜上殘留部分； ⑤乙醇沉淀:將步驟⑤收集物中邊攪拌邊加入1.5倍體積的95%乙醇，密封靜置過夜，使之充分沉淀，除去上層乙醇溶液；再分別用2倍體積的95%乙醇和無水乙醇各沉淀一次，收集沉淀，將所得沉淀于真空干燥箱中真空干燥，即得分離純化的肝素鈉。
2.根據權利要求1所述的一種高效提取肝素鈉的生產工藝，其特征在于:上述步驟①的酶解條件是:加入l%(m/v)蛋白復合酶酶解，收集上清液；酶解保溫2h ;離心的條件是:酶解液于 4°C、4000r/min 離心 15min。
3.根據權利要求1所述的一種高效提取肝素鈉的生產工藝，其特征在于:上述步驟②的樹脂采用D254型樹脂。
4.根據權利要求1所述的一種高效提取肝素鈉的生產工藝，其特征在于:上述步驟②攪拌速度為50_60r/min
5.根據權利要求1所述的一種高效提取肝素鈉的生產工藝，其特征在于:上述步驟③用分別用蒸餾水和1.2mol/L氯化鈉漂洗樹脂，加入I倍樹脂體積的4mol/L氯化鈉溶液洗脫。
6.根據權利要求1所述的一種高效提取肝素鈉的生產工藝，其特征在于:上述PAN膜截留分子量為3000-4000。
7.根據權利要求2所述的一種高效提取肝素鈉的生產工藝，其特征在于:上述蛋白復合酶為包含胃蛋白酶和胰蛋白酶的商用復合酶。
【專利摘要】本發明涉及一種高效提取肝素鈉的生產工藝，以終產物肝素鈉效價做為指標，以豬小腸黏膜做為原料，通過酶解-樹脂吸附/洗脫-膜分離-乙醇沉淀-干燥的生產工藝方法，從中提取高效價的抗凝血藥物肝素鈉。與傳統的鹽解-離子交換-乙醇沉淀法相比，酶法與膜分離技術和沉淀技術的有效結合，可以有效提高所提取肝素鈉的效價至160U/mg，比傳統方法提高近64%，最后回收率提高29%。同時，可以縮短后續精制工序，降低生產成本，提高肝素鈉分離的收率和效率。
【IPC分類】C08B37-10
【公開號】CN104725531
【申請號】CN201310722115
【發明人】董浩, 張秀民, 羅志良, 符紹輝, 程榆茗, 夏毅強, 高振宏
【申請人】安徽寶迪肉類食品有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2013年12月24日