具有烯基磺酰基團的熒光標記分子及其標記蛋白質的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白質巧光標記技術領域，具體設及具有締基橫酷基團的巧光標記分 子及其標記蛋白質的方法。
【背景技術】
[0002] 利用某些物質對蛋白質標記從而對其進行檢測分析的方法有多種，常用的方法有 同位素標記，巧光標記等。同位素標記對人體危害較大，同時也需要配備特殊儀器，故目前 該法使用較少；但它可W達到定量檢測分析的目的。使用更為廣泛的是利用巧光素對蛋白 質進行標記。
[0003] 目前巧光素對蛋白質進行標記的方法中，所采用的連接分子主要是班伯酷亞胺醋 和異硫氯酸醋。班伯酷亞胺醋是比較可靠的修飾蛋白的基團，而且易于保存，但是該連接基 團也容易和蛋白上的琉基反應，在水相中穩定性也較差。異硫氯酸醋在水中的穩定性比異 氯酸醋有了很大的提高，但是用異硫氯酸醋標記后的蛋白質偶聯物穩定性較差。因此，開發 新的用于蛋白質巧光標記的連接分子具有重要意義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是，提供具有締基橫酷基團的巧光標記分子及其標記蛋白質的方 法。旨在解決現有技術中蛋白質巧光標記的連接分子或蛋白偶聯物穩定性較差的技術問 題。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：
[0006] 一種具有締基橫酷基團的巧光標記分子，其結構如式（I)所示：
[0007]
【主權項】
1. 一種具有烯基磺酰基團的熒光標記分子，其結構如式（I)所示：
其中，R為熒光基團。
2. 如權利要求1所述的具有烯基磺酰基團的熒光標記分子，其特征在于：該熒光標記 分子為式（II )、式（III)、式（IV)、式（V )、式（VI)或式（VE)的化合物，
其中，Rp馬獨立選自H或者含有1到6個碳原子的直鏈或支鏈烷基或環烷基； X為〇、S或者NR3，所述R3選自H或者含有1到6個碳原子的直鏈或支鏈烷基或環烷 基； Y為〇或者CH2, η為0-5的整數。
3.權利要求2所述的式（III)化合物的制備方法，該方法為：
其具體步驟為： (1) 將化合物1與二碳酸二叔丁酯反應得到化合物2 ; (2) 將化合物3和二氯亞砜反應得到化合物4 ; (3) 將化合物2和有機堿溶解在有機溶劑中，加入化合物4,反應完成后經過后處理得 到化合物5 ; (4) 化合物5脫保護基得到化合物6 ; (5) 化合物6和三乙胺的二氯甲烷溶液中加入2-氯乙烷磺酰氯，反應完成后經過后處 理得到式（III)化合物。
4. 權利要求2所述的式（IV )化合物的制備方法，該方法為：
其具體步驟為： 化合物8和三乙胺的二氯甲烷溶液中加入化合物7反應完成后，經過后處理得到式 (IV )化合物。
5. 權利要求2所述的式（V )化合物的制備方法，該方法為：
其具體步驟為： (1) 將化合物8和化合物9用DCC處理得到化合物10 ; (2) 化合物10脫保護基得到化合物11 ; (3) 化合物11和三乙胺的二氯甲烷溶液中加入化合物7,反應完成后經后處理得到式 (V )化合物。
6. 權利要求2所述的式（VI)化合物的制備方法，該方法為：
其具體步驟為： 化合物12和三乙胺的二氯甲烷溶液中加入化合物7,反應完成后經過后處理得到式 (VI)化合物。
7. 權利要求2所述的式（W )化合物的制備方法，該方法為：
其具體步驟為： (1) 將化合物12和化合物9用DCC處理得到化合物13 ; (2) 化合物13脫保護基得到化合物14 ; (3) 化合物14和三乙胺的二氯甲烷溶液中加入化合物7,反應完成后經過后處理得到 式（VE)化合物。
8. 權利要求1或2所述的具有烯基磺酰基團的熒光標記分子在蛋白質熒光標記中的應 用。
9. 權利要求1或2所述的具有烯基磺酰基團的熒光標記分子與蛋白質偶聯的方法，該 方法為：所述烯基磺酰基團的烯基與蛋白質中氨基酸的氨基通過邁克爾加成反應，實現與 蛋白質的偶聯。
10. 如權利要求9所述的具有烯基磺酰基團的熒光標記分子與蛋白質偶聯的方法，其 特征在于：所述烯基與氨基的邁克爾加成反應在堿性磷酸緩沖液或者含有氨基的Tris緩 沖液中進行反應。
【專利摘要】本發明公開了具有烯基磺酰基團的熒光標記分子以及該熒光標記分子對蛋白質進行標記的方法。通過烯基磺酰氨基與熒光基團連接獲得所述熒光標記分子。該熒光標記分子通過其具有的烯基與蛋白質中氨基酸的氨基發生邁克爾加成反應，使熒光標記分子與蛋白質偶聯在一起。本發明中，烯基磺酰氨基能提高所述熒光標記分子的溶解度，并且烯基磺酰氨基在水中具有很高的穩定性，其中的烯基能在比較溫和的條件與蛋白質的氨基發生邁克爾加成反應，例如在磷酸緩沖液和Tris緩沖液中均可進行反應，所述熒光標記分子與蛋白質偶聯后，在人血清中的穩定性也有很大提高，在蛋白質熒光標記中具有很好的應用前景。
【IPC分類】C07K1-13, C07D311-12, C09K11-06, C07D493-10, C07D311-16
【公開號】CN104725338
【申請號】CN201510072342
【發明人】姜標, 曹剛, 楊建平
【申請人】中國科學院上海高等研究院
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年2月11日