一種轉錄組測序方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種轉錄組擴增測序檢測方法，特別涉及微量樣品中能夠同時覆蓋含 和不含多聚腺苷酸尾巴的核糖核酸種類的擴增測序技術。
【背景技術】
[0002] 隨著生命科學研究技術的發展，第二代高通量測序技術的開發，對生物體的研究 越來越詳盡和深入，發現生物體內同種細胞間往往存在異質性，這些個體的特征可能是影 響和引導生物體發育的重要因素，所以對單細胞水平的分析越來越重要。尤其是對單細胞 轉錄組的測序分析，可以直接反應不同細胞間的整體表達差異，反應細胞生長的調控狀態。
[0003] 細胞內的RNA主要包括帶有poly(A)尾的mRNA(約占細胞全部RNA的5% )，不帶 poly(A)尾的核糖體RNA(rRNA，占細胞全部RNA的90%以上）。對細胞轉錄組的測序分析 首先需要將不穩定的RNA通過體外逆轉錄反應變成較為穩定的DNA序列，然后進一步擴增 富集樣品，達到標準商業化方法建庫的起始量。為了防止含量過多的rRNA污染，目前存在 的單細胞轉錄組測序方法在逆轉錄中利用與P〇ly(A)互補配對的寡聚胸腺啼陡（oligdT) 作為引物，使得引物只能與帶有poly(A)尾的mRNA結合，不與不帶poly(A)尾的rRNA結 合。雖然該做法可以杜絕rRNA的污染，但是同時也將研究對象限定在了帶poly(A)尾的RNA 中，其中最為重要的一種是mRNA。隨著對轉錄組研究的不斷深入，發現細胞中還存在許多其 他種類的不帶poly(A)尾的RNA，比如長非編碼核糖核酸（long-noncodingRNA,IncRNA)， 環形核糖核酸（circularRNA)等，它們可能對細胞基因表達存在重要的調控作用，但在逆 轉錄時以oligdT作為引物的轉錄組測序方法中，由于引物不與不帶poly(A)尾的RNA結 合，該部分RNA的信息無法獲得。
[0004] 另一方面，現有技術中的轉錄組測序往往針對大量細胞（總核糖核酸在微克級） 進行，為減少rRNA干擾，在進行逆轉錄之前先用針對細胞中大量存在的rRNA的探針將其去 除之后再進行后續的實驗。而在少量細胞、甚至是單細胞的轉錄組測序時，由于去除rRNA 的步驟而帶來的其他RNA的損失是無法承受的。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術中存在的無法對轉錄組中不帶poly(A)尾的RNA進行測序，尤其是 無法對少量細胞轉錄組中不帶poly(A)尾的RNA進行測序的問題，本發明提供了一種能夠 逆轉錄出所有種類的RNA并將其擴增建庫的方法，該方法使用包含隨機序列的"隨機引物" 進行逆轉錄，不依賴P〇ly(A)尾，因此可以覆蓋所有核糖核酸種類。同時，由于反應溫度條 件的控制，可以減少rRNA的污染。
[0006] 本發明提供一種轉錄組測序方法，在RNA到CDNA的逆轉錄過程中所使用的引物包 含隨機序列和特定序列，隨機序列位于特定序列的3'端，二者之間有0-5個堿基，隨機序 列由4-12個隨機堿基組成，優選由6-8個隨機堿基組成（A、T、G、c中任意組合成六-八聚 體），特定序列為5-30個堿基的同聚體，優選為10-20個堿基的同聚體，更優選為15個堿基 的同聚體，特定序列的堿基選自A、G、C、T中任意一個。傳統利用oligdT作為引物的方法 中，由于引物結合位置都只能結合在mRNA鏈末端的聚腺苷酸尾巴上，導致絕大部分情況下 能夠覆蓋的片段都在整條核糖核酸鏈的末尾段，不利于研究基因轉錄的完整性以及揭示可 變剪切等現象。本發明的隨機引物理論上可以結合整條核糖核酸鏈的各個部位，因此可以 大大提高逆轉錄的均勻性，反映細胞中轉錄本的真實狀態。雖然隨機引物可以隨機的與任 何序列結合，但是由于引物本身設計在隨機組合的4-12個核糖核苷酸之后連接5-30個胸 腺啼陡（T)，更傾向于結合具有poly(A)尾的RNA序列，使得利用本方法對核糖體核糖核酸 的逆轉錄非常少（小于2% )，不對測序數據造成損失，同時同聚體的存在也很少引入引物 多聚體等人為的污染。
[0007] 在該方法中，無需去除核糖體RNA。
[0008] 在該方法中，所述的引物還包括錨定序列，錨定序列為cDNA擴增步驟中PCR引物 序列。
[0009] 在該方法中，所述RNA起始量為少量，甚至為單細胞當量，RNA起始量為 0?lpg-100ng，優選10pg-500pg。相應的細胞數量為1-10000個，優選1-100個，更優選1-10 個。
[0010] 在該方法中，逆轉錄之前加熱以釋放細胞中的RNA并破壞其二級結構，加熱的溫 度為60-80°C，加熱時間為10s-3min，優選30s-120s，更優選90s。rRNA具有比mRNA更為豐 富的二級結構。傳統步驟中，逆轉錄前對RNA65C5min的加熱會使rRNA結構充分打開，使在 后續步驟中引入rRNA干擾。而本方法通過精確控制加熱溫度和時間，使細胞中的RNA充分 釋放，同時避免打開rRNA的二級結構，從而減少對rRNA的逆轉錄。
[0011] 該方法包括如下步驟：（1)加熱，（2)逆轉錄反應獲得cDNA-鏈，（3)消化未反應 的引物，（4) 一鏈cDNA加polyA尾，（5)二鏈cDNA合成，（6)cDNA模板擴增反應，（7)擴增產 物的純化，（8)擴增cDNA片段的篩選，（9)二輪擴增，（10)二輪擴增產物純化及片段篩選，
[11] cDNA文庫構建及測序。
[0012] 在該方法中，一鏈cDNA加polyA尾的過程中，加入dATP和ddATP，所加入的dATP 和ddATP的摩爾比為50-200 :1，優選100 :1。傳統擴增方法實現單細胞核糖核酸測序技術 在第一條互補脫氧核糖核酸鏈（cDNA)形成后，直接加入末端轉移酶和一定濃度的脫氧腺 嘌呤核苷酸（dATP)，在末端加上一段聚腺苷酸，作為第二條互補脫氧核糖核酸鏈合成的引 物結合區。這一步往往由于酶的效率過高，在單細胞反應體系的小體系中（5ul)很難再修 改加入反應物的濃度和體積，導致合成的聚腺苷酸尾巴過長，污染測序數據。我們在發明中 引入雙脫氧腺嘌呤（ddATP)，一端可以與dATP結合，但結合之后另一端無法再繼續結合其 他堿基，這樣就可以終止聚脫氧腺嘌呤鏈的繼續延長。本發明中，我們以雙脫氧腺嘌呤：脫 氧腺嘌呤=1 :1〇〇的比例加入反應體系，可以合理控制添加的聚脫氧腺嘌呤鏈的長度，從 而使得測序得到的有效數據比例更高。
[0013] 本發明提供了一套完整的單細胞測序實驗技術，得到的樣品直接用于核酸文庫構 建操作，所以需要達到一定的文庫構建起始量，需要兩輪PCR(聚合酶鏈式反應）擴增反應， 第一輪和第二輪PCR反應的循環數分別是16-20,8-10不等，需要根據實驗起始細胞量的大 小（總的核糖核酸含量多少）決定。以l〇pg核糖核酸起始量為例，第一輪和第二輪擴增分 別需要20和10個循環。本方法尤其適用于微量實驗，雖然測序結果顯示，隨著起始核糖 核酸量的增加，會有更多的基因被覆蓋，但是ng級別的核糖核酸起始量已經達到飽和，過 度的擴增會帶來更大的噪聲，超過lng的樣品起始量得到的實驗結果穩定性可能反而不如 100pg〇
[0014] 使用本發明的單細胞核糖核酸測序技術擁有很高的技術重復性，在研究細胞間差 異時可以排除技術誤差，適于分析單細胞及微量核糖核酸樣品中含聚腺苷酸尾巴和不含聚 腺苷酸尾巴的核糖核酸，從而可以更全面研究單細胞轉錄組，對更多未知的核糖核酸展開 研究。
[0015] 本發明的有益效果是：（1)既能對帶有poly(A)尾的RNA進行測序，又能對不帶 poly(A)尾的RNA進行測序；(2)細胞轉錄組測序時無需rRNA去除步驟；（3)尤其適用于低 起始核糖核酸量和細胞數量的轉錄組的測序。
【附圖說明】
[0016] 以下結合附圖及【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細描述。
[0017] 圖1為實施例1中實驗流程示意圖。
[0018] 圖2為對使用本發明的方法檢測到的一種特定不帶poly(A)尾的環形RNA的驗證 結果圖。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1
[0020] 1.單細胞的裂解：
[0021] 配制如下裂解液：
【主權項】
1. 一種轉錄組測序方法，其特征在于，在RNA到cDNA的逆轉錄過程中所使用的引物包 含隨機序列和特定序列，隨機序列位于特定序列的3'端，二者之間有0-5個堿基，隨機序列 由4-12個隨機堿基組成，特定序列為5-30個堿基的同聚體，特定序列的堿基選自A、G、C、 T中任意一個。
2. 根據權利要求1所述的轉錄組測序方法，其特征在于，隨機序列由6-8個隨機堿基組 成，特定序列為10-20個堿基的同聚體。
3. 根據權利要求1所述的轉錄組測序方法，其特征在于，特定序列為15個堿基的同聚 體，特定序列的堿基為T。
4. 根據權利要求1所述的轉錄組測序方法，其特征在于，無需去除核糖體RNA。
5. 根據權利要求1所述的轉錄組測序方法，其特征在于，所述的引物還包括錨定序列， 錨定序列為cDNA擴增步驟中PCR引物序列。
6. 根據權利要求1所述的轉錄組測序方法，其特征在于，所述轉錄組可以來自少量細 胞，細胞個數為1-10000個，優選1-100個，更優選1-10個。
7. 根據權利要求1所述的轉錄組測序方法，其特征在于，所述轉錄組所包含的RNA起始 量為 0?lpg-100ng，優選 10pg-500pg。
8. 根據權利要求1所述的轉錄組測序方法，其特征在于，在逆轉錄之前進行加熱，加熱 的溫度為60-80°C，加熱的時間為10s-3min，優選30s-120s，更優選90s。
9. 根據權利要求1-8任一項所述的轉錄組測序方法，其特征在于，該方法包括如下步 驟：（1)加熱，（2)逆轉錄反應獲得cDNA-鏈，（3)消化未反應的引物，（4) 一鏈cDNA加 polyA尾，（5)二鏈cDNA合成，（6)cDNA模板擴增反應，（7)擴增產物的純化，（8)擴增cDNA 片段的篩選，（9)二輪擴增，（10)二輪擴增產物純化及片段篩選，（11)cDNA文庫構建及測 序。
10. 根據權利要求9所述的轉錄組測序方法，其特征在于，一鏈cDNA加poly(A)尾的過 程中，加入dATP和ddATP。
11. 根據權利要求10所述的轉錄組測序方法，其特征在于，所加入的dATP和ddATP的 摩爾比為50-200 :1，優選為100 :1。
【專利摘要】本申請提供一種轉錄組測序方法，在RNA到cDNA的逆轉錄過程中所使用的引物包含隨機序列和特定序列，隨機序列位于特定序列的3’端，二者之間有0-5個堿基，隨機序列由4-12個隨機堿基組成，特定序列為5-30個堿基的同聚體，特定序列的堿基選自A、G、C、T中任意一個。通過對逆轉錄引物的設計，本發明既能對帶有poly(A)尾的RNA進行測序，又能對不帶poly(A)尾的RNA進行測序，進行細胞轉錄組測序時無需rRNA去除步驟，尤其適用于低起始核糖核酸量和細胞數量的轉錄組的測序。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104711340
【申請號】CN201310690135
【發明人】黃巖誼, 湯富酬, 范小英, 張先念
【申請人】北京大學
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2013年12月17日