一種肺炎鏈球菌的莢膜染色方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物檢測領域，尤其涉及一種肺炎鏈球菌的莢膜染色方法。
【背景技術】
[0002] 莢膜是細菌在一定條件下分泌的粘液或膠態物質，通常是由多糖類、多肽類或多 糖蛋白復合體組成，不同的細菌其莢膜成分也有一定差異。肺炎鏈球菌莢膜主要是由多糖 組成，根據莢膜成分的不同可以分為90多個血清型（丁紹卿，葉人邦，袁曾麟.肺炎鏈球菌 血清學分型的研宄.生物制品學雜志.1988, 1 (1) : 18-22)，且不同型別的血清型莢膜厚度 有所不同。莢膜作為細菌的一種特殊結構，莢膜的低折光性與親和染料能力差等特性，使其 不易著色，制作一張好的莢膜染色玻片需要正確的染色方法和一定的熟練程度。
[0003] 傳統的細菌莢膜染色方法有赫氏（Hiss)染色法、墨汁染色法、Tyler染色法等。 凌體淑等人在之前的基礎上創建了新的細菌莢膜染色法（凌體淑，葉迎春，趙世鴻，等.細 菌莢膜染色的創新.現代醫學檢驗雜志.2004,19 (4): 35-36)。郭淑清等人以肺炎鏈球菌 為例對莢膜染色方法進行了改良（郭淑清，徐曉莉.莢膜染色法的改良.山西醫科大學學 報.2001，32(3) :276)。現有的莢膜染色法操作過程如下：
[0004] 1.赫氏（Hiss)染色法：
[0005] 將莢膜菌涂片，在空氣中自然干燥，不需加熱固定。滴加結晶紫染色液，在火焰上 微微加熱，使玻片上染液冒蒸汽為止，不要水洗，再用200g/L硫酸銅水溶液沖洗染液，切勿 用流水沖洗。用吸水紙吸干后油鏡觀察。
[0006] 觀察結果，菌體及背景呈紫色，莢膜呈淡紫色或無色。
[0007] 2?墨汁染色法：
[0008] 在載玻片上滴1滴印度墨水或黑色素水溶液，接種環取菌液一環，與染色液混合 均勻，取另一塊干凈的載玻片將混合物自載玻片一側平掛至另一側，又平掛回來，使形成一 薄層，在空氣中干燥。用吸水紙吸干后油鏡觀察。
[0009] 觀察結果：菌體及背景呈黑色，莢膜無色。
[0010] 3.Tyler法：
[0011] 按常規法涂片，在空氣中自然干燥。用Tyler染色液染5-7min，用20%CuS04水溶 液洗去結晶紫；用吸水紙吸干，并立即加1-2滴香柏油于涂片處，以防止CuS04結晶的形成； 先用低倍鏡再用高倍鏡觀察。
[0012] 結果：背景藍紫色，菌體紫色，莢膜無色或淺紫色。
[0013] 4.改良莢膜染色法：（凌體淑，葉迎春，趙世鴻，等.細菌莢膜染色的創新.現代醫 學檢
[0014]驗雜志? 2004, 19 (4) : 35-36)
[0015] ①菌涂片的制備：將肺炎鏈球菌接種于血清肉湯培養基，注射于小白鼠腹腔內，在 小白鼠腹腔內注射莢膜保護液，抽出腹腔液，再注射到另外的健康小白鼠腹腔內，然后取腹 腔液涂片。
[0016] ②莢膜染色：將上述涂片在空氣中自然干燥、固定，用5g/dl石碳酸復紅染色3m in(染液提前30min放37°C水浴箱預熱），用水沖去染液，傾去玻片上余水，再用特殊媒染 劑染3min，水沖洗，最后用1. 48g/dl美藍酒精飽和溶液染0. 5min，水沖洗，干燥后油鏡觀 察。
[0017] ③結果：肺炎鏈球菌菌體呈紫紅色，莢膜呈淺藍色，背景無色。
[0018] 上述方法以及其它的一些方法都存在一定的缺點：首先，操作過程比較復雜，對實 驗員的操作技能要求較高，容導致實驗失敗，重復性較差；其次，這些方法染色后能看到清 晰莢膜的菌體很少，需要在顯微鏡下大范圍查找，實際操作不方便；再次，由于細菌莢膜含 水量高，加熱會使菌體失水收縮，與細胞周圍染料脫離而產生透明的明亮區，導致假陽性出 現。此外，一些改良的莢膜染色方法，對莢膜的形態要求較高，在制備菌片的過程為增強莢 膜染色效果，需要添加莢膜保護液，操作繁瑣，耗時較長，并且成功率較低，重復性差。
[0019] 莢膜染色是肺炎鏈球菌菌種檢定中的一項重要檢測指標，因此，建立一種快速、簡 便、染色效果好的莢膜染色方法是非常必要的。
【發明內容】
[0020] 為滿足上述領域的需求，本發明提供一種針對肺炎鏈球菌的快速、高效的莢膜染 色方法。
[0021] 本發明請求保護的技術方案如下：
[0022] 一種用于肺炎鏈球菌的莢膜染色方法，包括以下步驟：
[0023] (1)制備細菌標本；
[0024] (2)涂片：取少量所述細菌標本，均勻涂于潔凈載玻片上，刮成薄層，自然晾干；
[0025] (3)染色：滴加100-150y1的石碳酸復紅染液于載玻片上，使之覆蓋均勾，自然晾 干；
[0026] (4)媒染：用水沖洗，自然晾干，滴加媒染劑，均勻覆蓋3-5min，用水沖洗，自然晾 干；
[0027] (5)鏡檢。
[0028] 所述石碳酸復紅染液為：50mg/ml石碳酸復紅溶液。
[0029] 所述媒染劑為：30mg/ml?6〇13溶液二份，150mg/ml單寧酸二份，200mg/ml硫酸錯 鉀飽和溶液五份，臨用前三天混合，室溫放置。
[0030] 所述細菌標本采用凍干的肺炎鏈球菌進行制備，制備方法為：取凍干的肺炎鏈球 菌，用無菌生理鹽水溶解，反復吹打混勻；將菌液滴加于10%羊血MH培養基上，涂布均勻， 然后置于6%C02培養箱中，37°C倒置培養16h-18h后，用生理鹽水洗下，備用。
[0031] 上述方法，其染色效果為：背景色為紅色，菌體為紫色，莢膜呈無色或淡粉色透明 圈。
[0032] 上述方法在肺炎鏈球菌菌種鑒定中的應用。
[0033] 本發明提供一種肺炎鏈球菌的莢膜染色方法，該方法采用負染法，使背景色為紅 色，菌體為紫色，莢膜呈無色或淡粉色透明圈。與現有的染色方法相比，本發明的莢膜染色 法具有以下優點：（1)保證了細菌莢膜的完整性，并且菌體清晰，容易辨認；（2)所染背景顏 色均一，莢膜與背景顏色反差大，莢膜典型，容易辨認，大大提高了肺炎鏈球菌菌種鑒定的 準確性；（3)包括細菌標本的制備、涂片、染色、媒染和鏡檢等步驟，實驗操作簡單，對實驗 員的技能和熟練程度要求不高，本領域普通技術人員均能操作，染色成功率高。
[0034] 在本發明的一些實施例中，采用本發明的方法對肺炎鏈球菌進行莢膜染色后，均 可觀察到清晰的莢膜形態，而對金黃色葡萄球菌進行染色后，未見到莢膜形態，因此，本發 明是一種針對肺炎鏈球菌的莢膜染色方法，能夠快速、高效地進行肺炎鏈球菌的菌種鑒定， 在肺炎的臨床治療中有利于醫生及時了解致病菌菌種，制定針對該菌種的治療方案，使患 者早日康復。
[0035] 在本發明的一些實施例中，所述石碳酸復紅染液優選50mg/ml石碳酸復紅溶液。
[0036] 在本發明的一些實施例中，所述媒染劑優選30mg/ml?6(：13溶液二份，150mg/ml單 寧酸二份，200mg/ml硫酸鋁鉀飽和溶液五份，臨用前三天混合，室溫放置。
[0037] 本發明肺炎鏈球菌的莢膜染色方法，細菌標本可采用凍干的肺炎鏈球菌進行制 備，也可以直接使用活化的肺炎鏈球菌菌液作為細菌標本。
[0038] 綜上所述，本發明提供一種針對肺炎鏈球菌的莢膜染色方法，所述方法簡單易行、 耗時短、成功率高、重復性好，能夠快速、高效地進行肺炎鏈球菌的菌種鑒定，在肺炎的臨床 診斷中有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0039] 圖1. 4型肺炎鏈球菌莢膜染色鏡檢結果（1000X)
[0040] 圖2. 11A型肺炎鏈球菌莢膜染色鏡檢結果（1000X)
[0041] 圖3. 12F型肺炎鏈球菌莢膜染色鏡檢結果（1000X)
[0042] 圖4. 15B型肺炎鏈球菌莢膜染色鏡檢結果（1000X)
[0043] 圖5. 17F型肺炎鏈球菌莢膜染色鏡檢結果（1000X)
[0044] 圖6. 19A型肺炎鏈球菌莢膜染色鏡檢結果（1000X)
[0045] 圖7. 20型肺炎鏈球菌莢膜染色鏡檢結果（1000X)
【具體實施方式】
[0046] 以下通過具體實施例對本發明進行更詳細的解釋，需要說明的是，下述實施例僅 作為對本發明的解釋和說明，而不是以任何方式限制本發明。
[0047] 實驗材料：
[0048] 菌種：肺炎鏈球菌菌種均購自中國藥品生物制品檢定所中國醫學細菌保藏管理中 心（NationalCenterforMedicalCultureCollections,CMCC)。本單位實驗室也有保 存，申請人聲明自申請日起二十年內，可向公眾發放用于必要的驗證試驗。
[0049] 表1?肺炎鏈球菌菌種信息表
[0050]
【主權項】
1. 一種用于肺炎鏈球菌的莢膜染色方法，包括以下步驟： (1) 制備細菌標本； (2) 涂片：取少量所述細菌標本，均勻涂于潔凈載玻片上，刮成薄層，自然晾干； (3) 染色：滴加100-150y1的石碳酸復紅染液于載玻片上，使之覆蓋均勾，自然晾干； (4) 媒染：用水沖洗，自然晾干，滴加媒染劑，均勻覆蓋3-5min，用水沖洗，自然晾干； (5) 鏡檢。
2. 根據權利要求1所述的方法，所述石碳酸復紅染液為：50mg/ml石碳酸復紅溶液。
3. 根據權利要求1所述的方法，所述媒染劑為：30mg/mlFeCl3溶液二份，150mg/ml單 寧酸二份，200mg/ml硫酸鋁鉀飽和溶液五份，臨用前三天混合，室溫放置。
4. 根據權利要求1所述的方法，所述細菌標本采用凍干的肺炎鏈球菌進行制備，制備 方法為：取凍干的肺炎鏈球菌，用無菌生理鹽水溶解，反復吹打混勻；將菌液滴加于10%羊 血MH培養基上，涂布均勻，然后置于6%C02培養箱中，37°C倒置培養16h-18h后，用生理鹽 水洗下，備用。
5. 根據權利要求1所述的方法，其染色效果為：背景色為紅色，菌體為紫色，莢膜呈無 色或淡粉色透明圈。
6. 權利要求1-5所述的方法在肺炎鏈球菌菌種鑒定中的應用。
【專利摘要】本發明“一種肺炎鏈球菌的莢膜染色方法”涉及微生物檢測領域。包括以下步驟：(1)制備細菌標本；(2)涂片：取少量所述細菌標本，均勻涂于潔凈載玻片上，刮成薄層，自然晾干；(3)染色：滴加100-150μl的石碳酸復紅染液于載玻片上，使之覆蓋均勻，自然晾干；(4)媒染：用水沖洗，自然晾干，滴加媒染劑，均勻覆蓋3-5min，用水沖洗，自然晾干；(5)鏡檢。本發明提供的針對肺炎鏈球菌的莢膜染色方法簡單易行、耗時短、成功率高、重復性好，能夠快速、高效地進行肺炎鏈球菌的菌種鑒定，在肺炎的臨床診斷中有良好的應用前景。
【IPC分類】C12Q1-14, C12R1-46
【公開號】CN104711315
【申請號】CN201510075085
【發明人】劉荷中, 趙澤坤, 翟振華
【申請人】北京華安科創生物技術有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年2月12日