一種重組黑曲霉葡萄糖氧化酶的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域中一種重組黑曲霉葡萄糖氧化酶的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C. 1. 1. 3. 4)是一種同型二聚體糖蛋白，由兩 個相同的多肽鏈通過二硫鍵共價結合組成，同時含有兩個非共價結合的黃素腺嘌呤二核苷 酸（FAD)輔因子，該酶以分子氧作為電子受體，可以氧化0-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧 化氫。
[0003] 葡萄糖氧化酶由于底物專一性強、催化效率高、無毒副作用，在醫療診斷、食品加 工、飼料及紡織工業中均有廣泛的應用價值。葡萄糖氧化酶能夠特異性識別葡萄糖，因此被 廣泛應用于臨床中葡萄糖含量的檢測，如尿糖的檢測、血糖的測定，可以有效監測糖尿病人 的尿糖、血糖含量。同時，葡萄糖氧化酶作為一種天然的食品添加劑，可以去除葡萄糖、脫除 氧氣，而且催化反應生成的葡萄糖酸對人體無害，生成的過氧化氫能夠起到有效的殺菌抑 菌作用，防止變質，延長食品保質期。
[0004] 葡萄糖氧化酶廣泛分布于動植物及微生物體內，但是動植物體內的葡萄糖氧化酶 含量低而且提取純化工藝復雜；目前葡萄糖氧化酶主要來源于微生物體內，如黑曲霉及青 霉，但是仍然存在產量低和提取純化難度大的問題。葡萄糖氧化酶在其它微生物表達宿主 中的表達水平也普遍不高（表1)，雖然在巴斯德畢赤酵母及釀酒酵母中的表達量較高，但 是發酵過程中均需要轉接而且需要用大量的甲醇進行誘導，程序繁瑣，成本高，更為重要的 是巴斯德畢赤酵母不是美國食品藥品監督管理局（FDA)認證的安全的微生物（GRAS微生 物），生物安全性存在隱患，不適合應用于食品和醫療領域中。因此，開發產量高、安全性高、 發酵提純工藝簡單、成本低的新的表達系統是十分必要的。
[0005] 表1、產葡萄糖氧化酶的菌株及其表達量
【主權項】
1. 核酸分子，是Agod基因或RNA分子， 所述Agod基因為如下a) -f)中任一所述的DNA分子或cDNA分子： a) 其編碼序列是SEQIDNo. 1的第4682-6520位的DNA分子或cDNA分子； b) 其編碼序列是SEQIDNo. 1的第4733-6520位的DNA分子或cDNA分子； c) 其編碼序列是SEQIDNo. 2的DNA分子或cDNA分子； d) 其編碼序列是SEQIDNo. 2的第52-1821位的DNA分子或cDNA分子； e) 與a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且與a)或 b)或c)或d)限定的核苷酸序列具有相同功能的cDNA分子或基因組DNA分子； f) 在嚴格條件下與a)或b)或c)或d)限定的核苷酸序列雜交，且與a)或b)或c)或 d)具有相同功能的cDNA分子或基因組DNA分子； 所述RNA分子為如下g)-j)中任一所述的RNA分子： g) 其編碼序列是將SEQIDNo. 1的第4682-6520位中的T均替換為U，其它核苷酸不 變得到的RNA分子； h) 其編碼序列是將SEQIDNo. 1的第4733-6520位中的T均替換為U，其它核苷酸不 變得到的RNA分子； i) 其編碼序列是將SEQIDNo. 2中的T均替換為U，其它核苷酸不變得到的RNA分子； j) 其編碼序列是將SEQIDNo. 2的第52-1821位中的T均替換為U，其它核苷酸不變 得到的RNA分子。
2. 與權利要求1所述核酸分子相關的遺傳材料，為下述B1)至B5)中至少一種： B1)含有權利要求1所述核酸分子的表達盒； B2)含有權利要求1所述核酸分子的重組載體、或含有B1)所述表達盒的重組載體； B3)含有權利要求1所述核酸分子的重組微生物、或含有B1)所述表達盒的重組微生 物、或含有B2)所述重組載體的重組微生物； B4)含有權利要求1所述核酸分子的轉基因植物細胞系、或含有B1)所述表達盒的轉基 因植物細胞系、或含有B2)所述重組載體的轉基因植物細胞系； B5)含有權利要求1所述核酸分子的轉基因動物細胞系、或含有B1)所述表達盒的轉基 因動物細胞系、或含有B2)所述重組載體的轉基因動物細胞系。
3. 重組細胞的構建方法，包括對受體細胞中導入權利要求1所述Agod基因，得到產葡 萄糖氧化酶的重組細胞。
4. 根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于：所述受體細胞為微生物細胞、非人動 物細胞或植物細胞。
5. 根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于：所述微生物為真菌、細菌、酵母或藻。
6. 根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于：所述真菌為木霉屬真菌。
7. 根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于：所述木霉屬真菌為里氏木霉。
8. 按照權利要求3-7中任一所述方法構建的重組細胞。
9. 制備葡萄糖氧化酶的方法，包括培養權利要求3-8中任一所述重組細胞，得到葡萄 糖氧化酶。
10. 下述1)或2)或3)所述的應用： 1)權利要求1所述核酸分子在制備葡萄糖氧化酶中的應用； 2) 權利要求2所述遺傳材料在制備葡萄糖氧化酶中的應用； 3) 權利要求8所述重組細胞在制備葡萄糖氧化酶中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種重組黑曲霉葡萄糖氧化酶的制備方法及其應用。將本發明的Agod基因導入里氏木霉Tu6△tku70中構建的重組里氏木霉Tu6△tku70::Agod能夠成功地表達重組黑曲霉葡萄糖氧化酶，而且表達量較高，發酵液中的酶活力可達到137U/mL，是目前產葡萄糖氧化酶菌株中搖瓶發酵酶活力的最高水平。將發酵液中的重組黑曲霉葡萄糖氧化酶通過鎳柱純化后測定的酶活力可達到342U/mL，重組黑曲霉葡萄糖氧化酶的比活力為155U/mg蛋白。采用本發明的方法制備的重組黑曲霉葡萄糖氧化酶具有很好的熱穩定性和較好的酸堿耐受性，發酵工藝簡單，不需轉接，原料廉價易得，成本大大降低，可廣泛應用于食品醫療領域中。
【IPC分類】C12N15-80, C12N1-15, C12N9-04, C12R1-885, C12N15-53
【公開號】CN104711273
【申請號】CN201510115372
【發明人】董志揚, 馬枝枝, 陳秀珍, 林潔, 黃振邦, 秦麗娜
【申請人】中國科學院微生物研究所
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年3月17日