一種小鼠脾臟細胞的培養方法

一種小鼠脾臟細胞的培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種小鼠脾臟細胞的培養方法，具體涉及一種能夠使小鼠脾臟細胞長 期貼壁的培養方法，屬于生命科學細胞培養技術領域。
【背景技術】
[0002] 原代細胞不僅廣泛應用于分子、細胞生物學和生物醫學基礎研宄，如蛋白質組學、 基因組學、細胞株研宄等，還可應用于當今熱門的生物醫藥產業如藥物篩選、藥物代謝和毒 理研宄等。原代細胞在生物醫藥領域有不可替代性作用，市場前景廣闊。通常原代細胞不 能長時間培養，并且傳代2-3次后就無法繼續傳代。
[0003] 脾臟是機體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細胞 和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。脾臟中有許多細胞在體外培養時不能貼 壁生長，例如B淋巴細胞、T淋巴細胞、紅細胞、NK細胞等，但也有一些細胞能夠貼壁生長。 貼壁生長的細胞對不能貼壁生長的細胞在固定、分化等方面起著重要作用。雖然目前已經 對如B淋巴細胞、T淋巴細胞等脾臟中不能貼壁的細胞已經進行了很多詳細的研宄，但是對 脾臟中能貼壁的細胞研宄較少，因此急需一種能夠使小鼠脾臟細胞長期貼壁生長的培養方 法，以為對這些細胞的研宄奠定基礎。

【發明內容】

[0004] 為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種小鼠脾臟細胞的培養方 法，該培養方法能夠實現小鼠脾臟中貼壁細胞的連續傳代，能夠使小鼠脾臟細胞生長時間 超過六個月。
[0005] 為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：
[0006] -種小鼠脾臟細胞的培養方法，該培養方法包括如下步驟：
[0007] 1)分離脾臟細胞：無菌條件下取出小鼠脾臟，然后采用80~150目的篩網碾磨分 離脾臟細胞，邊碾磨邊滴加含有體積分數為20 %的胎牛血清的RPMI1640培養液；然后收集 篩網濾出液；
[0008] 2)在細胞培養瓶中加入含有體積分數為10~20 %的胎牛血清的RPMI1640培養 液，將步驟1)收集的篩網濾出液轉移至細胞培養瓶中并置于36~38°C、0. 5%C02條件下 進行培養，培養時間為45~75天；
[0009] 3)當步驟2)中的細胞長滿細胞培養瓶時，按照1 :2的比例進行連續傳代培養。
[0010] 在上述方法中，在分離脾臟細胞之前還包括以下前處理步驟：
[0011] 1)配制小鼠表面消毒液：往濃度為75%的酒精中加入0. 1~0. 5M的NaOH和占酒 精體積〇. 1~1%的甲醛，攪拌均勻待用；
[0012] 2)小鼠前處理：將小鼠脫臼處死，然后將小鼠放入步驟1)中制得的消毒液中消毒 至少30min，處理溫度為20~25°C。
[0013] 作為本發明的優選方案，在進行小鼠消毒過程中使用鑷子或其他工具晃動小鼠， 以促使消毒液與小鼠的體表和毛發全方位接觸。
[0014] 具體地，在步驟1)分離脾臟細胞中含有20%的胎牛血清的RPMI1640培養液的滴 加量為5~15ml。
[0015] 具體地，在步驟2)和步驟3)連續傳代培養的培養過程中每隔15天更換培養液。
[0016] 作為本發明的優選方案，連續傳代培養每個代次的培養時間為30~45天。
[0017] 實現本發明的一種實施方式是：所述連續傳代培養至少傳代5代以上。
[0018] 具體地，第一次傳代的細胞培養時間為60天；第二次傳代的細胞培養時間為45 天；第三次傳代的細胞培養時間為40天；第四次傳代的細胞培養時間為40天；第五次傳代 的細胞培養時間為35天。
[0019] 相比現有技術，本發明的有益效果在于：
[0020] 本發明所述的小鼠脾臟細胞的培養方法通過采用含有10~20 %胎牛血清的 RPMI1640培養液對小鼠脾臟細胞進行培養，并通過合理控制小鼠脾臟中貼壁細胞的培養條 件和傳代時間，使得小鼠脾臟貼壁細胞能夠1~2月傳一代，很好地解決了目前普通的哺乳 動物傳代培養方法不能實現小鼠脾臟中貼壁細胞的連續傳代和長時間培養的問題，大大延 長了小鼠脾臟細胞中貼壁細胞的生長時間，實現了小鼠脾臟中貼壁細胞的連續傳代，能夠 使小鼠脾臟中貼壁細胞連續傳代5代以上，生長時間超過6個月。
[0021] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0022] 圖1為按本發明所述方法培養的脾臟細胞F1代生長第3天時的細胞狀況圖；
[0023] 圖2為脾臟細胞F1代生長第15天時的細胞狀況圖；
[0024] 圖3為脾臟細胞F1代生長第30天時的細胞狀況圖；
[0025] 圖4為脾臟細胞F1代生長第60天長滿時的細胞狀況圖；
[0026] 圖5為脾臟細胞F2代生長第15天時的細胞狀況圖；
[0027] 圖6為脾臟細胞F2代生長第30天時的細胞狀況圖；
[0028] 圖7為脾臟細胞F2代生長第45天長滿時的細胞狀況圖；
[0029] 圖8為脾臟細胞F3代生長第15天時的細胞狀況圖；
[0030] 圖9為脾臟細胞F3代生長第40天長滿時的細胞狀況圖；
[0031] 圖10為脾臟細胞F4代生長第15天時的細胞狀況圖；
[0032] 圖11為脾臟細胞F4代生長第40天長滿時的細胞狀況圖；
[0033] 圖12為脾臟細胞F5代生長第15天時的細胞狀況圖；
[0034] 圖13為脾臟細胞F5代生長第35天長滿時的細胞狀況圖。
【具體實施方式】
[0035] 實施例1 :
[0036] -種小鼠脾臟細胞的培養方法，該培養方法包括如下步驟：
[0037] 1)配制小鼠表面消毒液：往濃度為75%的酒精中加入0. 2M的NaOH和占酒精體積 0.1 %的甲醛，攪拌均勻待用；
[0038] 2)小鼠前處理：將BALB/c小鼠脫白處死，然后將小鼠放入步驟1)中制得的消毒 液中消毒30min，處理溫度為25°C，消毒過程中使用鑷子或其他工具晃動小鼠，趕出附著在 皮膚和毛發上的氣體，以促使消毒液與小鼠的體表和毛發全方位接觸；
[0039] 3)分離脾臟細胞：無菌條件下取出小鼠脾臟，然后采用100目的篩網碾磨分離脾 臟細胞，邊碾磨邊滴加l〇ml含有20%的胎牛血清的RPMI1640培養液（Gibco公司）；然后 收集篩網濾出液；
[0040] 4)在25cm2細胞培養瓶中加入含有體積分數為20%的胎牛血清的RPMI1640培養 液（Gibco公司），將步驟1)收集的篩網濾出液轉移至細胞培養瓶中并置于37°C、0. 5%C02 條件下進行培養；
[0041] 5)培養過程中每隔15天更換培養基，當步驟2)中的細胞長滿細胞培養瓶時，按照 1 :2的比例進行連續傳代培養；
[0042] 6)細胞第一次傳代后將細胞置于相同的條件下培養，當細胞長滿細胞培養瓶時按 照1 :2的比例進行連續傳代。
[0043] 上述細胞連續傳代情況如圖1~圖13、下表所示：
[0044] 表1、細胞連續傳代情況
【主權項】
1. 一種小鼠脾臟細胞的培養方法，其特征在于：該培養方法包括如下步驟： 1) 分離脾臟細胞：無菌條件下取出小鼠脾臟，然后采用80~150目的篩網碾磨分離脾 臟細胞，邊碾磨邊滴加含有體積分數為20%的胎牛血清的RPMI1640培養液；然后收集篩網 濾出液； 2) 在細胞培養瓶中加入含有體積分數為10~20%的胎牛血清的RPMI1640培養液，將 步驟1)收集的篩網濾出液轉移至細胞培養瓶中并置于36~38°C、0. 5%C02條件下進行培 養，培養時間為45~75天； 3) 當步驟2)中的細胞長滿細胞培養瓶時，按照1 :2的比例進行連續傳代培養。
2. 根據權利要求1所述的小鼠脾臟細胞的培養方法，其特征在于：在分離脾臟細胞之 前還包括以下前處理步驟： 1) 配制小鼠表面消毒液：往濃度為75%的酒精中加入0. 1~0. 5M的NaOH和占酒精體 積0. 1~1%的甲醛，攪拌均勻待用； 2) 小鼠前處理：將小鼠脫臼處死，然后將小鼠放入步驟1)中制得的消毒液中消毒至少 30min，處理溫度為20~25°C。
3. 根據權利要求2所述的小鼠脾臟細胞的培養方法，其特征在于：在進行小鼠消毒過 程中使用鑷子或其他工具晃動小鼠，以促使消毒液與小鼠的體表和毛發全方位接觸。
4. 根據權利要求1所述的小鼠脾臟細胞的培養方法，其特征在于：在步驟1)中含有 20%的胎牛血清的RPMI1640培養液的滴加量為5~15ml。
5. 根據權利要求1所述的小鼠脾臟細胞的培養方法，其特征在于：培養過程中每隔15 天更換培養液。
6. 根據權利要求1所述的小鼠脾臟細胞的培養方法，其特征在于：連續傳代培養每個 代次的培養時間為30~45天。
7. 根據權利要求1所述的小鼠脾臟細胞的培養方法，其特征在于：所述連續傳代培養 至少傳代5代以上。
8. 根據權利要求7所述的小鼠脾臟細胞的培養方法，其特征在于：第一次傳代的細胞 培養時間為60天；第二次傳代的細胞培養時間為45天；第三次傳代的細胞培養時間為40 天；第四次傳代的細胞培養時間為40天；第五次傳代的細胞培養時間為35天。
【專利摘要】本發明涉及一種小鼠脾臟細胞的培養方法，具體涉及一種能夠使小鼠脾臟細胞長期貼壁的培養方法，屬于生命科學細胞培養技術領域。該培養方法包括如下步驟：1)分離脾臟細胞：無菌條件下取出小鼠脾臟，然后采篩網碾磨分離脾臟細胞，收集篩網濾出液；2)在細胞培養瓶中加入培養液，將步驟1)收集的篩網濾出液轉移至細胞培養瓶中進行培養，培養時間為45～75天，培養過程中每隔15天更換培養基；4)當細胞長滿細胞培養瓶時按照1：2的比例進行連續傳代。該培養方法能夠實現小鼠脾臟中貼壁細胞的連續傳代，能夠使小鼠脾臟細胞生長時間超過六個月。
【IPC分類】C12N5-078
【公開號】CN104711222
【申請號】CN201510152418
【發明人】蔣春英, 陳瑞愛, 徐家華, 王新秋, 張東霞
【申請人】肇慶大華農生物藥品有限公司, 廣東大華農動物保健品股份有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年3月31日