一種單鏈抗體及其在檢測硫代磷酸酯類農藥殘留中的應用
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及一種單鏈抗體及其在檢測硫代磷酸酯類農藥殘留中的應用。
【背景技術】：
[0002] 硫代磷酸酯類農藥屬于有機磷農藥的一類，其結構上的特點是均有硫代磷酸酯基 骨架。這類化合物多呈油狀或結晶狀，工業品呈淡黃色至棕色，大多有蒜臭味。一般不溶于 水，易溶于有機溶劑如苯、丙酮、乙醚、三氮甲烷及油類，對光、熱、氧均較穩定，遇堿易分解 破壞。
[0003] 硫代磷酸酯類農藥具有對害蟲高效，防治譜廣，作用方式多樣，品種繁多，不同品 種間毒性差異較大等特點，而被廣泛應用于農業生產和衛生害蟲防治領域。伴隨著硫代磷 酸酯類農藥的廣泛使用而帶來的農藥殘留問題也日趨嚴重。在現實生活中，有機磷農藥對 人體的暴露主要來自食品、飲用水和居住環境等，其中食品是殘留農藥攝入人體的最重要 來源，特別是長期低劑量暴露有機磷農藥帶來的慢性毒性問題日益受到人們的關注。有機 磷農藥主要通過抑制乙酰膽堿酯酶活性發揮其神經毒性作用，長期低劑量接觸該類農藥會 對人體神經及相關行為產生負面影響。對長期接觸毒死蜱的人群研宄發現，人體的神經傳 導的速度、對振動的敏感性、視覺、嗅覺、神經行為能力等均與沒有接觸有機磷農藥的人群 有明顯的差異，且情緒異常、疲勞等癥狀較易出現。長期低劑量暴露有機磷農藥能夠引起中 樞神經系統高級認知功能的損傷，造成自主神經功能障礙、神經精神改變、學習記憶、語言 等認知功能障礙。癌癥病變發生與長期接觸低劑量有機磷農藥也存在一定的相關性。此外， 生殖毒性也是研宄者探宄有機磷農藥慢性毒性問題的關注點，大部分有機磷農藥對精子的 數量、質量均有不良影響。
[0004] 有機磷農藥正逐步向超高效低殘留的環保型發展趨勢邁進，在農產品和環境中的 殘留量也會很低，并且多種農藥殘留共存，尤其是發達國家對農產品中農藥最大殘留限量 標準的設立十分嚴格。這就要求在農產品農藥殘留檢測時，盡量排除待測樣品中其他物質 的干擾，采用高靈敏度的檢測方法來實現。目前有機磷農藥殘留檢測應用最為廣泛的方法 是儀器檢測，即色譜技術，如氣相色譜（GC)、高效液相色譜（HPLC)，以及在此基礎上發展并 得以應用的色譜-質譜聯用技術等。這類檢測方法具有準確性高，靈敏度好，穩定性高等特 點，但是這類檢測方法需要昂貴的實驗儀器和專業的技術人員，使用環境也受到限制。相比 傳統的儀器檢測方法，免疫分析方法被越來越多的應用到農藥殘留檢測領域，其中最具代 表性的方法是酶聯免疫分析法（ELISA)，ELISA方法具有快速，靈敏，低成本，適合大樣本高 通量檢測及實時檢測等特點而被廣泛應用于有機磷農藥殘留檢測領域。目前國內外開發的 有機磷類農藥酶聯免疫分析試劑盒中的抗體多采用多克隆抗體或單克隆抗體技術制備，這 種制備方法費用高昂，產量低，極大的限制免疫分析方法的更廣泛使用。同時被開發出的試 劑盒多為檢測譜單一的，只可特定檢測某一種化合物或是農藥，無法實現對農藥殘留分析 的多組分平行檢測。
【發明內容】
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[0005] 本發明的目的是提高一種單鏈抗體及其在檢測硫代磷酸酯類農藥殘留的應用。
[0006] 本發明提供的單鏈抗體，是由鼠源抗體重鏈可變區、輕鏈可變區、連接肽組成的多 肽；所述的重鏈可變區如序列表的序列1自N末端第1至119位氨基酸序列所示；所述輕鏈 可變區如序列表的序列1自N末端第135至241位氨基酸序列所示；所述連接肽位于所述 重鏈可變區與所述輕鏈可變區之間，所述連接肽如序列表的序列1自N末端第120至134 位氨基酸序列所示。
[0007] 所述單鏈抗體具體可為序列表的序列1所示的多肽。
[0008] 本發明保護編碼所述單鏈抗體的基因，由所述重鏈可變區編碼序列、所述輕鏈可 變區編碼序列和所述重鏈可變區的編碼序列組成。
[0009] 所述的重鏈可變區編碼序列可如序列表的序列2自5'末端第14至370位核苷酸 所示；所述輕鏈可變區的編碼序列可如序列表的序列2自5'末端第417至736位核苷酸所 示。所述的連接肽編碼序列可如序列表的序列2自5'末端第371至416位核苷酸所示。
[0010] 所述基因具體可如序列表的序列2自5'末端第9至736位核苷酸所示的DNA分 子。
[0011] 含有所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒均屬于本發明的 保護范圍。
[0012] 所述重組載體具體可為將所述編碼基因插入pCANTAB5e噬菌粒載體得到的重組 質粒。更具體可為將所述編碼基因插入pCANTAB5e噬菌粒載體的SfiI和NotI酶切位點 之間得到的重組質粒。
[0013] 所述重組菌具體可為將所述重組質粒導入大腸桿菌得到的重組菌，更具體可為將 所述重組質粒導入大腸桿菌TG1菌株或大腸桿菌HB2151菌株得到的重組質粒。
[0014] 本發明還保護所述編碼基因編碼表達的單鏈抗體，是由重組菌經發酵培養后得到 的單鏈抗體。
[0015] 本發明還保護所述單鏈抗體在檢測硫代磷酸酯類農藥殘留中的應用。
[0016] 所述硫代磷酸酯類農藥具體可為乙硫磷、樂果、稻豐散、毒死婢、喹硫磷、三唑磷或 二嗪農。
[0017] 本發明基于抗體抗原特異性結合的原理，設計合成硫代磷酸酯類農藥通用半抗 原，并將制備的通用人工抗原免疫小鼠，對小鼠的抗體可變區進行定向誘變，并采用重組單 鏈抗體技術制備抗體，從而獲得對硫代磷酸酯類農藥特異性結合的單鏈抗體。本發明采用 重組抗體技術制備單鏈抗體，并采用噬菌體展示技術對抗體文庫進行高效篩選，通過這種 方法制備抗體可以降低成本，并大量制備抗體。
[0018] 本發明提供的單鏈抗體對多種硫代磷酸酯類農藥均有良好的交叉反應率，靈敏度 高，適用于多殘留硫代磷酸酯類農藥的快速免疫檢測。綜上，所述發明抗體將在硫代磷酸酯 類農藥殘留檢測中發揮重大作用。
【附圖說明】
[0019] 圖1為scFv基因構建電泳圖；A:輕鏈編碼基因電泳圖；B:重鏈編碼基因電泳圖； C:scFv全基因電泳圖。
[0020] 圖2為可溶性抗體表達部位分析圖；supernatant為上清液中可溶性抗體組分 ELISA結果；periplasm為包間質中可溶性抗體組分ELISA結果；wholecell為全細胞中可 溶性抗體組分ELISA結果。
[0021] 圖3為可溶性抗體SDS-PAGE電泳檢測結果圖；泳道1為重組菌可溶性蛋白組分電 泳圖；泳道2為對照菌可溶性蛋白組分電泳圖。
[0022] 圖4為可溶性抗體Westernblotting鑒定圖；泳道1中scFv所示條帶為可溶性 抗體條帶。
[0023] 圖5為半抗原標準抑制曲線圖。
【具體實施方式】
[0024] 下述實施例有助于理解本發明，但并不限制本發明的內容。
[0025] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0026] 下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0027] 實施例1、重組單鏈抗體的制備
[0028] -、硫代磷酸酯類化合物通用半抗原的合成及人工抗原的制備
[0029]1、用10mL去離子水溶解氯乙酸（945mg，lOmmol)，加入等摩爾量的氫氧化鈉，得氯 乙酸鈉鹽水溶液；用5mL去離子水將0, 0-二乙基二硫代磷酸銨鹽（1.75g，lOmmol)溶于 50mL圓底反應瓶中，升溫至80°C后，逐滴加入氯乙酸鈉鹽溶液，滴加時間約為30min，磁力 攪拌，約6h后終止反應；待反應液冷卻至室溫，用等摩爾量的鹽酸酸化，二氯甲烷萃取3次， 合并有機相，無水硫酸鈉干燥，柱層析得淡黃色油狀液體。獲得硫代磷酸酯類化合物通用半 抗原，簡稱H2如式（I)所示。
【主權項】
1. 一種單鏈抗體，是由鼠源抗體重鏈可變區、輕鏈可變區和位于兩者之間的連接肽組 成的多肽，所述重鏈可變區編碼序列如序列表的序列2自5'末端第14至370位核苷酸所 示；所述輕鏈可變區的編碼序列如序列表的序列2自5'末端第417至736位核苷酸所示； 所述的連接肽編碼序列如序列表的序列2自5'末端第371至416位核苷酸所示。
2. 如權利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于：所述單鏈抗體為序列表的序列1所示 的多肽。
3. 編碼權利要求1所述單鏈抗體的基因，由所述輕鏈可變區的編碼序列、所述重鏈可 變區的編碼序列和所述連接肽的編碼序列組成。
4. 如權利要求3所述的基因，其特征在于：所述的重鏈可變區編碼序列如序列表的序 列2自5'末端第14至370位核苷酸所示；所述輕鏈可變區的編碼序列如序列表的序列2 自5'末端第417至736位核苷酸所示。
5. 如權利要求4所述的連接肽編碼序列如序列表的序列2自5'末端第371至416位 核苷酸所示。
6. 如權利要求5所述的基因，其特征在于：所述基因為序列表的序列2自5'末端第9 至736位核苷酸所示的DNA分子。
7. 含有權利要求3至6中任一所述基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系或表達盒。
8. -種制備權利要求1或2所述抗體的方法，其特征在于，將權利要求3至6任一所述 的編碼基因導入到宿主細胞中，培養，得到的所述抗體。
9. 根據權利要求8所述方法，其特征在于：所述方法中，是通過重組載體將權利要求3 至6所述編碼基因導入宿主細胞中的；所述重組載體中既含有權利要求3至6所述重鏈可 變區的編碼基因又含有權利要求3至6所述輕鏈可變區的編碼基因，且所述的重鏈可變區 編碼基因和所述輕鏈可變區的編碼基因在所述重組載體中受同一啟動子的調控。
10. 權利要求1或2中任一所述單鏈抗體在檢測硫代磷酸酯類農藥殘留中的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種單鏈抗體及其在檢測硫代磷酸酯類農藥殘留中的應用。本發明制備的單鏈抗體，是由鼠源的輕鏈可變區、重鏈可變區和位于兩者之間的連接肽組成的多肽；該抗體，重鏈可變區如序列表的序列1自N末端第1至119位氨基酸序列所示；所述輕鏈可變區如序列表的序列1自N末端第135至241位氨基酸序列所示；所述連接肽位于所述重鏈可變區與所述輕鏈可變區之間，所述連接肽如序列表的序列1自N末端第120至134位氨基酸序列所示。實驗結果證實，本發明制備的單鏈抗體對多種硫代磷酸酯類農藥具有良好的交叉反應率和高親和力，適用于多種硫代磷酸酯類農藥的快速免疫檢測，在農藥殘留檢測領域有廣闊的應用前景。
【IPC分類】G01N33-53, C12N15-13, C12N1-19, C07K16-18, C12N15-63, C12N1-21, C12N1-15
【公開號】CN104710531
【申請號】CN201410813915
【發明人】祁志軍, 王東方, 劉爽, 寇立泉, 趙吉健, 吳文君
【申請人】楊凌農科大農藥研究所
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2014年12月23日