卵形鯧鲹家系親子鑒定的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及魚類育種和分子標記技術領域，具體涉及一種利用微衛星分子標記鑒 定卵形鯧鰺混養家系子代親本的方法。
【背景技術】
[0002] 卵形娼錄隸屬隹盧形目（Perciformes)，錄科（Carangidae)，娼錄亞科 (Trachinotinae)，娼鰺屬（Trachinotus)，俗稱金娼，黃臘娼等，是一種中上層暖水性魚類， 廣泛分布于熱帶、亞熱帶海域，具有生長速度快，肉嫩味美，營養價值高等特點，現已成為我 國南方沿海池塘和網箱養殖的重要經濟品種。
[0003] 近些年來，卵形鯧鰺市場需求量大幅上升，已經成為南方海水養殖魚類的最大宗 種類，目前我國金娼商品魚年產量20萬噸以上，僅廣東湛江魚類交易市場每天就有500噸 冰鮮卵形鯧鰺交易量。這樣大的市場對卵形鯧鰺苗種的需求量也是非常巨大的。卵形鯧鰺 是暖水性海水魚類，卵形鯧鰺受溫度條件影響養殖區域主要集中在海南、廣東、福建等地。 而海南地處亞熱帶、熱帶地區，海水溫度相對較高，適宜卵形鯧鰺的孵化與育苗。目前，三省 區所有卵形鯧鰺養殖苗種均來自于海南地區。由于卵形鯧鰺普遍存在近親繁殖的現象，導 致苗種種質退化，生長緩慢，病害爆發等問題日益凸顯。傳統苗種繁殖產業所采用的野種 家養模式面臨著巨大的挑戰，對于卵形鯧鰺進行良種選育便成為水產養殖研宄者迫在眉睫 的任務。
[0004] 家系選育是魚類育種的重要基礎手段，是根據某個或某幾個性狀明顯優于其親 屬、生產性能顯著高于其親屬的混有不同類型的原始群里選出一些優良個體留種，建立幾 個或若干個家系并繁殖后代，逐代與原始群體及對照品種相比較，選留那些符合原定選擇 指標的優良系統，進而進行品系性能測定。在魚類育種中，家系選育尤為重要，幾乎所有育 成種類均需要經過家系選育這一步驟。目前魚類人工家系的建立通常采用1 (雌）對1 (雄） 交配生產子代。這樣的方式建立的家系數量較少，而且單獨管理每個家系受環境影響較大， 對家系選擇不利；而對混合家系進行個體的物理標記，在較多家系的情況下非常困難。目前 對于卵形鯧鰺繁殖成熟度及雌雄性別的判斷比較困難，也并不適用1對1的生產方式。因 此對于卵形鯧鰺家系的建立和家系的鑒定一直是難以解決的問題，在很大程度上阻礙的 卵形鯧鰺育種工作。
[0005] 微衛星DNA(Microsatellites DNA)是廣泛分布于真核生物基因組中的一種中度 重復序列。微衛星標記以其多態性豐富，共顯性遺傳的優點被廣泛應用于群體遺傳結構分 析，性狀分析，種質鑒定，家系鑒定，遺傳作圖等領域。親本的微衛星遺傳信息可以通過繁 殖傳遞給子代，微衛星標記技術通過檢測不同親子個體的微衛星差異區分個體所屬家系。 目前尚未見將微衛星標記用于卵形鯧鰺家系鑒定的報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供了一種利用微衛星標記鑒定卵形鯧鰺家系的方法，為卵形鯧 鰺育種提供親子鑒定的分子標記工具。
[0007] 為了實現上述目的，本發明的技術方案為：提供一種卵形鯧鰺家系親子鑒定的方 法，該方法包括如下步驟：
[0008] 1)選擇卵形鯧鰺體型較大，生長速度較快的個體87尾作為親本，將親本混合進行 人工繁殖；待魚苗長到10公分時隨機選取1萬尾轉入網箱養殖，作為用于親子鑒定的家系 群體；
[0009] 2)選取步驟1)的卵形鯧鰺繁殖親本的鰭條組織，提取基因組DNA，以DNA為模板， 選用51對微衛星引物進行巢式PCR擴增；
[0010] 3)步驟2)所述的巢式PCR擴增方法指PCR體系內包含3個引物：位點特異性正向 引物，其5'末端加M13序列（5' -CAGTCGGGCGTCATCA-3'）；位點特異性反向引物；FAM、PET、 VIC、NED四種熒光標記的M13通用引物；PCR反應體系20ul :50ng DNA，2ul dNTP(2. 5mM)， 2ullOXBuffer mixture，1U rTaq，0. 4ul 的含加通用引物M13 的正向引物（lOmM)，0? 5ul 反 向引物，0. lul的熒光標記通用引物，ddH20補足；
[0011] 4)卵形鯧鰺親本在51個微衛星位點的PCR產物經ABI3730型基因分析儀，根據熒 光標記進行基因型分析，使用Genemapper3. 7軟件模擬分析，篩選出適合鑒定卵形娼鰺混 養家系的有效微衛星位點 11 個：ZD13、ZD15、TBG008、ZD02、ZD03、ZD04、ZD11、ZD12、ZD01、 ZD10、TBG016 ;
[0012] 5)將卵形鯧鰺1萬條子代混養7月齡，隨機選取2000尾個體，在每條魚的背部肌 肉植入電子標記并剪取每個個體鰭條組織，提取個體基因組DNA，選取步驟4)中的11個有 效微衛星位點，分析子代的基因型；
[0013] 6)根據親本和子代在11個微衛星位點的基因型，采用PAPA 2. 0軟件對不同子代 進行區分，鑒定子代個體的父母本。
[0014] 其中步驟4)所述的11對有效微衛星引物的核苷酸序列如下所示。
[0015] 表1卵形鯧鰺親子鑒定微衛星引物
[0016]
【主權項】
1. 一種卵形鯧鰺家系親子鑒定的方法，該方法包括如下步驟： 1) 選擇卵形鯧鰺體型較大，生長速度較快的個體87尾作為親本，將親本混合進行人 工繁殖；待魚苗長到10公分時隨機選取1萬尾轉入網箱養殖，作為用于親子鑒定的家系群 體； 2) 選取步驟1)的卵形鯧鰺繁殖親本的鰭條組織，提取基因組DNA，以DNA為模板，選用 51對微衛星引物進行巢式PCR擴增； 3) 步驟2)所述的巢式PCR擴增方法指PCR體系內包含3個引物：位點特異性正向引 物，其5'末端加M13序列（5' -CAGTCGGGCGTCATCA-3'）；位點特異性反向引物；FAM、PET、 VIC、NED四種熒光標記的M13通用引物；PCR反應體系20ul:50ngDNA，2uldNTP(2. 5mM)， 2ullOXBuffermixture，IUrTaq，0. 4ul的含加通用引物M13 的正向引物（IOmM)，0? 5ul反 向引物，0.Iul的熒光標記通用引物，CldH2O補足； 4) 卵形鯧鰺親本在51個微衛星位點的PCR產物經ABI3730型基因分析儀，根據熒光標 記進行基因型分析，使用Genemapper3. 7軟件模擬分析，篩選出適合鑒定卵形娼鰺混養家 系的有效微衛星位點 11 個：ZD13、ZD15、TBG008、ZD02、ZD03、ZD04、ZD11、ZD12、ZD01、ZD10、 TBGO16 ； 5) 將卵形鯧鰺1萬條子代混養7月齡，隨機選取2000尾個體，在每條魚的背部肌肉植 入電子標記并剪取每個個體鰭條組織，提取個體基因組DNA，選取步驟4)中的11個有效微 衛星位點，分析子代的基因型； 6) 根據親本和子代在11個微衛星位點的基因型，采用PAPA2. 0軟件對不同子代進行 區分，鑒定子代個體的父母本。
【專利摘要】本發明公開了一種卵形鯧鲹家系親子鑒定的方法，針對采用多親本制備混合家系的實例，篩選出11對遺傳多樣性高、擴增效率穩定的微衛星引物。結合毛細管電泳測序及軟件分析，達到檢測卵形鯧鲹家系個體親子關系的目的。通過本發明的方法，卵形鯧鲹親子鑒定準確率能夠達到90％以上。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104694660
【申請號】CN201510128615
【發明人】駱劍, 陳國華, 張國慶, 吳光燦, 王珺
【申請人】海南大學
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月24日