一種口蹄疫疫苗宿主細胞dna殘留量的定量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種DNA殘留量的定量檢測方法，特別涉及一種口蹄疫疫苗宿主細胞 DNA殘留量的定量檢測方法，屬于獸用生物制品檢測領域。
【背景技術】
[0002] 口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒（FMDV)引起偶蹄類動物 感染的一種急性、烈性、接觸性傳染病，主要危害豬、牛、羊等70種家畜和野生動物，人也易 感，對畜牧業危害極大。臨床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發生水皰性瘆。
[0003] 口蹄疫病毒（FMDV)被認為是最重要的經濟獸醫病原，是因為其高度傳染性的性 質和該病毒已對禽畜業造成的破壞性影響。根據它的特點，口蹄疫被國際獸疫局（0IE)定 為一類傳染病，中國農業部也將其列為一類傳染病。隨著世界經濟的發展，各國間的相互交 流日益頻繁，現代運輸快速發展，這都增加了 口蹄疫預防的難度和復雜度。因此對口蹄疫疫 苗質量要求越來越高，致使用以衡量疫苗質量。
[0004] 根據WHO有關規程規定，用傳代細胞系制造的疫苗或疫苗毒種在傳代歷史中曾經 用過傳代細胞系者，其外源DNA污染最低量應低于100pg/劑量。BHK21細胞是目前研制口 蹄疫疫苗的較理想的候選株，為了安全起見，需對口蹄疫疫苗宿主細胞BHK21細胞殘余DNA 含量進行檢測。近年來，分子生物學的發展推動了診斷技術的進步，核酸探針由于其高度的 特異性和敏感性而備受人們的青睞，尤其對病毒和細菌病的診斷檢測，使其具有誘人前景。 用特異性核酸探針做斑點分子雜交，其特異性較穩定，其檢測靈敏度可達lpg的同源核酸。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種簡單、準確地檢測口蹄疫疫苗宿主細胞DNA殘留量的 方法，用以衡量疫苗質量及安全性。
[0006] 為了達到上述目的，本發明采用的技術手段為：
[0007] -種口蹄疫疫苗宿主細胞DNA殘留量的定量檢測方法，其特征在于，采用核酸探 針斑點雜交法對BHK21細胞DNA標準品和待測樣品中BHK21細胞DNA進行顯影，得到兩者 的斑點印跡，然后對BHK21細胞DNA標準品的斑點印跡進行分析，根據分析結果對待測樣品 中BHK21細胞DNA殘留量進行對比定量和精確定量。
[0008] 在本發明中，優選的，采用地高辛隨機引物法標記BHK21細胞基因組制成探針。 [0009] 在本發明中，優選的，待測樣品無需進行DNA的提取和純化，直接點在NC膜上進行 烘烤固定。
[0010] 在本發明中，優選的，所述的對比定量為根據待測樣品中BHK21細胞DNA的斑點印 跡對比標準比色條去確定待測樣品中BHK21細胞DNA殘留量范圍；其中，所述的標準比色條 為不同濃度的BHK21細胞DNA標準品的斑點印跡。
[0011] 在本發明中，優選的，所述的精確定量為應用Quantity One軟件分析BHK21細胞 DNA標準品斑點印跡積分光密度值，從而得到表示BHK21細胞DNA濃度與其斑點印跡積分光 密度值關系的標準方程，將待測樣品中BHK21細胞DNA斑點印跡積分光密度值代入標準方 程，即可得到待測樣品中BHK21細胞DNA殘留量。
[0012] 在本發明中，優選的，所述的采用地高辛隨機引物法標記BHK21細胞基因組制成 探針的具體步驟為：
[0013] (1)、BHK21細胞DNA標準品模板應用超聲破碎DNA，超聲強度為40%，時間為10分 鐘，然后用高壓蒸餾水稀釋到lug/16ul;
[0014] (2)、BHK21細胞DNA標準品模板120°C加熱變性lOmin，迅速冰浴；
[0015](3)、混合地高辛隨機引物4ul加入經變性的BHK21細胞DNA標準品模板中，充分 混合并且瞬時離心，37°C孵育20小時；
[0016] (4)、65°C孵育 lOmin，終止反應。
[0017] 在本發明中，優選的，所述的采用核酸探針斑點雜交法對BHK21細胞DNA標準品和 待測樣品中BHK21細胞DNA進行顯影的具體步驟為：
[0018] (1)樣品固定
[0019] 用2 X SSC緩沖液簡單洗NC膜1次，吸取待測樣品3ul點膜，同時吸取BHK21細胞 DNA標準品3ul與待測樣品并列點膜，將膜120°C烘烤30min取出；
[0020] (2)雜交檢測
[0021] ①DIG Easy Hyb緩沖液預熱到雜交溫度，將DNA固定后的膜放入預雜交緩沖液， 在適當的容器中溫和振蕩30分鐘，進行預雜交；
[0022] ②地高辛標記的DNA探針，將探針放入沸水浴中變性，5分鐘后立即置于冰上或冰 水浴中冷卻；
[0023] ③將變性的地高辛標記探針加入到預熱的DIG Easy Hyb緩沖液中，充分混勻；
[0024] ④倒出預雜交液，在膜上加入探針雜交液，37°C下溫和振蕩孵育至過夜；
[0025](3)免疫檢測
[0026] ①用SSC液嚴謹洗滌后，將膜簡單地用洗滌緩沖液漂洗1~5分鐘；
[0027] ②在100ml封閉溶液工作液中孵育30分鐘；
[0028] ③在50ml抗體溶液工作液中孵育30分鐘；
[0029] ④用100ml洗滌緩沖液洗滌2次，每次15分鐘；
[0030] ⑤在100ml檢測緩沖液中平衡2~5分鐘；
[0031] (4)顯影
[0032] 將含DNA樣品的膜面朝上，置于折疊夾中，向膜上滴加lml CDP-star，ready-to-use，使CDP-star均勻浸潤膜，立即蓋上封蓋并防止氣泡的產生，使底 物在膜上的分布更加均勻。擦去溢出折疊夾或雜交袋的多余液體，15~25°C孵育5min。在 15~25°C條件下，用X光片曝光15~25分鐘，得到兩者的斑點印跡。
[0033] 隨機引物標記法是以六聚寡核苷酸為引物，待標記的DNA為模板，在DNA聚合酶 Klenow片段作用下，將DIG-11-dUTP摻入到新合成的DNA鏈中，適用于100bp~2Kb的DNA 探針的標記。隨機序列的六脫氧核苷酸沿DNA的多個位點與熱變性的單鏈模板雜交。這些 寡核苷酸在隨后的聚合反應中作為3'-羥基引物，在加入Klenow聚合酶和所有4種核苷 酸（含Digoxigenin-11-dUTP)后，探針合成開始，在Klenow聚合酶催化下，加入的核苷酸 底物沿5' -3'聚合延伸，生成高效標記的探針。該法一般可允許10ng~3yg范圍內探 針有效地標記。每20~25個核苷酸中帶有一個Digoxigenin-11-dUTP。標記效率高，且模 板DNA片段的大小不影響標記結果。
[0034] 本發明中的待測樣品無需進行DNA的提取和純化，直接點在NC膜上進行烘烤固 定，可以對細胞培養物的特異序列進行快速檢測，將整個細胞點到膜上，再按常規方法進行 雜交與檢測，可以同時檢測大量待測樣品。
[0035] 本發明應用比色條進行DNA殘留量區間估算，可以根據實驗得到的斑點印跡，對 比標準品比色條確定待測樣品中BHK21細胞DNA殘留量范圍。
[0036] 在本發明的一個具體實施例中，本發明應用Quantity One軟件分析斑點印跡的積 分光密度值，利用標準方程計算待測樣品中BHK21細胞DNA殘留量。應用Quantity One軟 件得到4個BHK21細胞DNA標準品濃度（60ug/ml、50ug/ml、40ug/ml或30ug/ml)所對應的 積分光密度值，依照得到的4個積分光密度值確立標準曲線建立方程。
[0037] BHK21細胞DNA標準品濃度與積分光密度值的對應關系如下：
【主權項】
1. 一種口蹄疫疫苗宿主細胞DNA殘留量的定量檢測方法，其特征在于，采用核酸探針 斑點雜交法對BHK21細胞DNA標準品和待測樣品中BHK21細胞DNA進行顯影，得到兩者的 斑點印跡，然后對BHK21細胞DNA標準品的斑點印跡進行分析，根據分析結果對待測樣品中 BHK21細胞DNA殘留量進行對比定量和精確定量。
2. 根據權利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于，采用地高辛隨機引物法標記 BHK21細胞基因組制成探針。
3. 根據權利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于，待測樣品無需進行DNA的提取和 純化，直接點在NC膜上進行烘烤固定。
4. 根據權利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于，所述的對比定量為根據待測樣 品中BHK21細胞DNA的斑點印跡對比標準比色條去確定待測樣品中BHK21細胞DNA殘留量 范圍；其中，所述的標準比色條為不同濃度的BHK21細胞DNA標準品的斑點印跡。
5. 根據權利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于，所述的精確定量為應用 QuantityOne軟件分析BHK21細胞DNA標準品斑點印跡積分光密度值，從而得到表示BHK21 細胞DNA濃度與其斑點印跡積分光密度值關系的標準方程，將待測樣品中BHK21細胞DNA 斑點印跡積分光密度值代入標準方程，即可得到待測樣品中BHK21細胞DNA殘留量。
6. 根據權利要求2所述的定量檢測方法，其特征在于，所述的采用地高辛隨機引物法 標記BHK21細胞基因組制成探針的具體步驟為： (1) 、BHK21細胞DNA標準品模板應用超聲破碎DNA，超聲強度為40%，時間為10分鐘， 然后用高壓蒸餾水稀釋到lug/16ul; (2) 、BHK21細胞DNA標準品模板120°C加熱變性lOmin，迅速冰浴； (3) 、混合地高辛隨機引物4ul加入經變性的BHK21細胞DNA標準品模板中，充分混合 并且瞬時離心，37°C孵育20小時； (4) 、65°C孵育lOmin，終止反應。
7. 根據權利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于，所述的采用核酸探針斑點雜交 法對BHK21細胞DNA標準品和待測樣品中BHK21細胞DNA進行顯影的具體步驟為： (1) 樣品固定 用2XSSC緩沖液簡單洗NC膜1次，吸取待測樣品3ul點膜，同時吸取BHK21細胞DNA標準品3ul與待測樣品并列點膜，將膜120°C烘烤30min取出； (2) 雜交檢測 ①DIGEasyHyb緩沖液預熱到雜交溫度，將DNA固定后的膜放入預雜交緩沖液，在適 當的容器中溫和振蕩30分鐘，進行預雜交； ② 地高辛標記的DNA探針，將探針放入沸水浴中變性，5分鐘后立即置于冰上或冰水浴 中冷卻； ③ 將變性的地高辛標記探針加入到預熱的DIGEasyHyb緩沖液中，充分混勻； ④ 倒出預雜交液，在膜上加入探針雜交液，37°C下溫和振蕩孵育至過夜； (3) 免疫檢測 ① 用SSC液嚴謹洗滌后，將膜簡單地用洗滌緩沖液漂洗1~5分鐘； ② 在100mL封閉溶液工作液中孵育30分鐘； ③ 在50ml抗體溶液工作液中孵育30分鐘； ④ 用100mL洗滌緩沖液洗滌2次，每次15分鐘； ⑤ 在100mL檢測緩沖液中平衡2~5分鐘； (4)顯影 將含DNA樣品的膜面朝上，置于折疊夾中，向膜上滴加ImlQ)P-star，ready-t〇-use， 使CDP-star均勻浸潤膜，立即蓋上封蓋并防止氣泡的產生，使底物在膜上的分布更加均 勻。擦去溢出折疊夾或雜交袋的多余液體，15~25°C孵育5min。在15~25°C條件下，用 X光片曝光15~25分鐘，得到兩者的斑點印跡。
【專利摘要】本發明公開了一種口蹄疫疫苗宿主細胞DNA殘留量的定量檢測方法，采用核酸探針斑點雜交法對BHK21細胞DNA標準品和待測樣品中BHK21細胞DNA進行顯影，得到兩者的斑點印跡，然后對BHK21細胞DNA標準品的斑點印跡進行分析，根據分析結果對待測樣品中BHK21細胞DNA殘留量進行對比定量和精確定量。本發明采用地高辛隨機引物法直接標記BHK21細胞基因組制成探針并且待測樣品直接點NC膜固定無需進行DNA的提取和純化，此方法更適合細胞侵染擴增病毒后的細胞中DNA檢測，較針對部分基因的探針的檢測結果更準確、更簡單。同時本發明實現了對口蹄疫疫苗宿主細胞BHK21細胞中DNA殘留量的定量檢測，可以用于衡量疫苗質量及安全性。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104694640
【申請號】CN201510080925
【發明人】趙宏凱, 趙炳武, 武俊蘭, 王永偉, 張澍, 何召慶, 呂宏亮, 劉金萍
【申請人】內蒙古必威安泰生物科技有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月15日