一種用于檢測沙門氏菌的探針、試劑盒和方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測用的探針，具體涉及一種用于檢測沙門氏菌的探針、試劑盒 和方法。
【背景技術】
[0002] 沙門氏菌是臨床上重要的致病菌，2012年WHO數據顯示：全球每年由沙門氏菌感 染引起的死亡病例達210萬，其中100萬以上是5歲以下兒童。據統計，中國53%的沙門氏 菌可引起兒童的社區獲得性肺炎，7% -9%的沙門氏菌感染會引起細菌性腦膜炎。此外，中 國是沙門氏菌引起感染病例最多的國家之一，占全球病例的12 %，也是5歲以下兒童沙門 氏菌感染引起死亡病例數最多的國家之一。為有效控制沙門氏菌感染的傳播，以及降低疾 病造成的危害，建立準確，快速的檢測方法是首要任務。
[0003]目前臨床上檢測沙門氏菌常用的方法有細菌培養法、乳膠凝集法和PCR法。其中 細菌培養法是檢測沙門氏菌的金標準，但（1)抗生素的廣泛使用要以使其分離率大大降 低；（2)非侵襲性疾病不伴有菌血癥，血液培養難有陽性結果；（3)因為沙門氏菌常在上呼 吸道定植，呼吸道標本的細菌培養結果會受到干擾。深部呼吸道標本的細菌培養可以確診， 去需要侵入性操作，如肺穿刺等，通常令患兒的家長難以接受。此外該方法需要二氧化碳培 養箱和脫纖維羊血培養基，并且需要16-18小時才能看到檢測結果，檢測成本高、檢測周期 長。乳膠凝集法原理是利用沙門氏菌莢膜的抗原性，用覆蓋了所有沙門氏菌血清型的抗體 來致敏乳膠顆粒。有沙門氏菌存在時，其莢膜上的抗原和乳膠顆粒上的抗體可發生抗原抗 體反應，產生肉眼可見的乳膠顆粒凝集現象。此法可以快速鑒定沙門氏菌。乳膠凝集法的局 限性在于如果檢測的細菌數量較少，會出現假陰性結果，需要傳以獲得足夠量的菌；此外有 些C群鏈球菌可能發生假陽性反應。利用PCR方法可在短時間內使特定的核酸序列拷貝 數幾何級數增加，有很高的靈敏度和特異性，但缺點是假陽性率高，另一方面，患者分泌物 中有往往含有抑制PCR反應的成分，這又會導致假陰性的出現，這兩方面的缺點限制了 PCR 檢測的臨床應用。目前，已有用熒光原位雜交（FISH)檢測沙門氏菌的報道，但均采用的是 線形探針，該方法的缺點是，雜交完成后，必須用嚴格的洗滌條件來除去未雜交的探針，而 且經常會因為探針清洗不完全而造成假陽性。由此可見，沙門氏菌感染的臨床診斷，急需更 簡潔、靈敏的檢測方法。
[0004] 分子信標探針（Molecular beacon probe)，具有靈敏度高、特異性強、只有和革巴序 列雜交上了才會發出熒光等優點，被應用于熒光原位雜交。本發明通過對大量沙門氏菌和 其它細菌菌株的16S rRNA序列進行比對，挑選沙門氏菌的特異性序列，設計、合成分子信標 探針，建立穩定的分子信標原位雜交反應體系，克服了沙門氏菌當前臨床檢測的諸多問題， 為沙門氏菌感染的診斷、預防和控制提供新的檢測方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了一種探針，所述探針能 用于檢測沙門氏菌，通過熒光原位雜交的手段，本發明還提供了一種快速、靈敏、特異性地 檢測沙門氏菌的試劑盒和方法。
[0006] 為實現上述目的，所采取的技術方案：一種用于檢測沙門氏菌的探針，所述 探針為分子信標探針，所述分子信標探針的堿基序列為5 ' -CTGCATATTGGAAACGATAG CTAATTGCAG-3'（SEQ ID N0:1);所述探針由頸、環兩部分組成，其中環部分的序列為 TATTGGAAACGATAGCTAAT，環部分的序列固定不變，用于與沙門氏菌16sRNA結合；莖部分的 序列位于探針序列的兩端，是除去環部分以外的探針序列，莖部分的序列可變，只要兩端莖 序列互補即可
[0007] 優選地，所述探針5'端的熒光基團為FITC、FAM和Cy3中的一種，所述探針3'端 的熒光淬滅基團為DABCYL、BDH和TANRA中的一種。
[0008] 優選地，所述探針的5'端用FAM標記，3'端用DABCAL標記，熒光基團激發波長 495nm，檢測波長520nm。
[0009] 本發明所述探針是通過核酸雜交的原理檢測沙門氏菌的，其樣品的來源包含但不 限于食品、水源、土壤、臨床樣本以及這些樣品的培養物等；
[0010] 本發明提供了一種基于熒光原位雜交快速檢測沙門氏菌的試劑盒，所述試劑盒包 括：
[0011] (1)上述所述的探針；
[0012] ⑵重懸固定液；
[0013] (3)雜交液；
[0014] (4)洗滌液；
[0015] 所述重懸固定液包括：
【主權項】
1. 一種基于熒光原位雜交檢測沙門氏菌的分子信標探針，其特征在于，所述探針為分 子信標探針，所述分子信標探針的堿基序列為5' -CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-3' ； 所述探針由頸、環兩部分組成，其中環部分的序列為TATTGGAAACGATAGCTAAT，環部分的序列 固定不變，用于與沙門氏菌16sRNA結合；莖部分的序列位于探針序列的兩端，是除去環部 分以外的探針序列，莖部分的序列可變，只要兩端莖序列互補即可。
2. 根據權利要求1所述的用于檢測沙門氏菌的探針，其特征在于，所述探針5'端的熒 光基團為FITC、FAM和Cy3中的一種，所述探針3'端的熒光淬滅基團為DABCYL、BDH和TANRA 中的一種。
3. 根據權利要求1所述的用于檢測沙門氏菌的探針，其特征在于，所述探針的5'端用 FAM標記，3'端用DABCAL標記，熒光基團激發波長495nm，檢測波長520nm。
4. 一種基于熒光原位雜交快速檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包 括： (1) 權利要求1或2中所述的探針； (2) 重懸固定液； (3) 雜交液； (4) 洗滌液； 所述重懸固定液包括：
5. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述雜交液包括5 % (w/v)PEG，50mM NaCl，40% (v/v)甲酰胺,0.5% (w/v)過硫酸銨，1% (w/v)DEPC，l% (w/v)聚鹿糖，50mM EDTA，0. 1% (v/v)TritonX-100,50mMpH8. 0 的Tris-HCl; 所述洗滌液包括 50mMpH10. 0 的Tris-HCl，0. 5MNaCl，0. 1% (v/v)NP-40,0. 5% (v/v)TritonX-100。
6. -種采用如權利要求3-4任一所述試劑盒快速檢測沙門氏菌的方法，其特征在于， 所述方法包括以下步驟： (la)取待檢樣品，加入到重懸固定液中，震蕩混勻； (2a)取步驟（la)中混勻后的液體滴在載玻片上，然后烘干； (3a)將步驟（2a)中獲得的載玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干； (4a)在浸泡后的載玻片上的待檢位置加入雜交液和探針，置于雜交爐中避光雜交； (5a)將步驟（4a)中獲得的載玻片浸入預熱的洗滌液中洗滌，然后烘干； (6a)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用10X物鏡掃視和計數，用40或100X物鏡 觀察細菌形態； 或者所述方法包括以下步驟： (lb)取待檢樣品，加入到重懸固定液中，震蕩混勻； (2b)過濾得到濾液； (3b)取步驟（2b)中得到的濾液滴在載玻片上，然后烘干； (4b)將步驟（3b)中獲得的載玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干； (5b)在浸泡后的載玻片上的待檢位置加入雜交液和探針，置于雜交爐中避光雜交； (6b)將步驟（5b)中獲得的載玻片浸入預熱的洗滌液中洗滌，然后烘干； (7b)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用10X物鏡掃視和計數，用40或100X物鏡 觀察細菌形態。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟（la)、（lb)中所述待檢樣品與 所述重懸固定液的體積比為1:1~1:5,所述步驟（2a)中所述液體滴加的體積為10iiL,所 述步驟（3b)中所述濾液滴加的體積為10iiL，所述步驟（2a)、（3a)、（5a)、（3b)、（4b)、（6b) 中的烘干溫度為52°C，所述步驟（3a)、（4b)中所述浸泡時間為5分鐘，所述步驟（5a)、（6b) 中洗滌液的預熱溫度為55°C，所述步驟（5a)、（6b)中所述洗滌時間為5分鐘。
8. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟（3a)、（4b)中所述雜交液的加 入體積為20iiL,所述探針加入后的終濃度為20ng/L。
9. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟（3a)、（4b)中雜交溫度為52°C， 雜交時間為30分鐘。
【專利摘要】本發明公開了一種用于熒光原位雜交檢測沙門氏菌的分子信標探針，所述分子信標探針的堿基序列為：5’-FAM-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-DABCAL-3’；所述探針的5’端用FAM標記，3’端用DABCAL標記，熒光基團激發波長495nm，檢測波長520nm。本發明的分子信標探針信號強度高，并且特異性高，可以有效、快速地檢測沙門氏菌。本發明還公開了一種快速檢測沙門氏菌的試劑盒及檢測方法。
【IPC分類】C12R1-42, C12N15-11, C12Q1-68, C12Q1-10
【公開號】CN104694638
【申請號】CN201510079374
【發明人】方國偉, 洪冉, 劉振世, 易春
【申請人】蘇州達麥迪生物醫學科技有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月13日