一種紫菜多肽原液的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程領域的技術領域，尤其涉及一種紫菜多肽原液的制備方法。
【背景技術】
[0002]紫菜含有高達30%左右的蛋白質以及碘、多種維生素和無機鹽類，味道鮮美，除食用外還可用以治療甲狀腺腫大和降低膽固醇，是一種重要的經濟海藻，廣泛分布于世界各地，但以溫帶為主。
[0003]目前紫菜的加工方式比較單一，主要是做成紫菜干制品，食用時需要泡發、烹調等處理，或是將紫菜烤熟之后經調味處理而成海苔。因此，一些研究者進一步探究了紫菜深加工的方式，通過提取出紫菜中的營養成分，用以制備天然產物，或是以此為基礎開發飲料。研究證明，紫菜含有豐富的紫菜多肽，它具有降血壓的功效，為此，提取制備紫菜多肽也成為研究的熱點。
[0004]在現有技術中，通常采用蛋白酶降解法來制備紫菜多肽，蛋白酶的酶解時間在5小時以上，且降解后的沉淀物被直接丟棄。本發明人經過大量的研發和實踐，在一次對紫菜進行蛋白酶降解實驗中，對沉淀物進行分析，發現還存在大量未被蛋白酶降解的紫菜底物，本發明人再試圖增加蛋白酶量及延長酶解時間，但最終沉淀物仍然還有大量未被降解的紫菜底物，也就是說，在一次蛋白酶解過程中，不管是增加蛋白酶量還是延長酶解時間，對于紫菜多肽的提取率來說，增加的幅度都是非常有限。因此沉淀物酶解后被大量丟棄也得到了 “合乎情理”的解釋。有鑒于此，本發明研究和設計了一種紫菜多肽原液的制備方法，本案由此產生。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種紫菜多肽原液的制備方法，通過蛋白酶二次降解法，以進一步提聞紫菜多妝的提取率。
[0006]為實現上述目的，本發明解決其技術問題的技術方案是:
一種紫菜多肽原液的制備方法，包括以下步驟:
步驟一、制備紫菜顆粒勻漿:
以壇紫菜為原料，烘干后用高速粉碎機粉碎，形成干紫菜粉，所述干紫菜粉加水過夜浸泡使之充分溶脹，再用砂磨機進一步研磨，成顆粒細小的紫菜顆粒勻漿；
步驟二、采用二次酶法酶解:
第一次酶解時，將所述紫菜顆粒勻漿作為底物，將蛋白酶按質量百分比1.5%，以所述干紫菜粉重量計，加入所述底物中，調PH至2-9，在35~60°C下酶解3h，得到酶解液LI，將所述酶解液LI在15000Xg、4°C條件下離心30min，得到上清液SI和沉淀物S2 ；
第二次酶解時，按質量體積比1:10，以所述干紫菜粉重量計，將沉淀物S2加入水中使之重懸，得到紫菜懸浮液，將蛋白酶按質量百分比1.0%，以所述干紫菜粉重量計，加入所述紫菜懸浮液中，調PH至2-9，在35~60°C下酶解2h，得到酶解液L2，將所述酶解液L2在8000 X g、4°C條件下離心15min，得到上清液S3和沉淀物S4，棄去所述沉淀物S4，收集、合并所述上清液SI和所述上清液S3，得到上清液S5 ；
步驟三、分離純化:
將所述上清液S5在沸水浴中煮1min滅酶，之后在8000 X g、4°C條件下離心15min，得到上清液S6和沉淀物S7,棄去所述沉淀物S7,收集所述上清液S6，即為紫菜多肽原液。
[0007]作為實施例的優選方式，所述步驟一中，將所述干紫菜粉按照質量體積比1:15加入水中，在4°C下過夜浸泡。
[0008]作為實施例的優選方式，所述步驟一中，所述砂磨機的轉速為2000r/min，研磨時間為80min。
[0009]作為實施例的優選方式，所述的蛋白酶為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶或風味酶以及上述酶的組合。
[0010]本發明的有益效果是:采用多重破碎、酶解工藝，將紫菜烘干后進行粉粹、研磨，使紫菜細胞充分破碎，有利于內容物充分釋放出來，利用復合酶進行二次酶解，進一步將離心后紫菜渣中殘留的蛋白質轉化成多肽，提高了多肽提取率，充分利用了紫菜原料，節約成本，且操作簡單。
【具體實施方式】
[0011]下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0012]本發明以壇紫菜為原料，經過烘干、粉碎、加水浸泡、研磨等處理，得到顆粒細小的紫菜顆粒勻漿，加入一定量的蛋白酶二次酶解，得到酶解液，酶解液經滅酶、離心處理后即得紫菜多肽原液。
[0013]通過GB 50095-2010中的第一法凱氏定氮法測定紫菜原液中蛋白質含量，以評估紫菜多肽的提取率。通過血管緊張素轉移酶(ACE)的體外抑制實驗來反應紫菜多肽的降血壓活性。
[0014]紫菜多肽降血壓活性的測定
(1)10 μ I 的 5mM 反應底物 Hip-His-Leu，10 μ I 的 0.lU/ml ACE 和 10 μ I 的 0.2Μ 硼酸緩沖液(ΡΗ8.3，含有0.3 M NaCl)組成了體外ACE催化反應體系。在37°C下反應30min之后，加入25 μ I的IM鹽酸終止反應。向反應體系中再加入150 μ I的乙酸乙酯，振蕩5分鐘使其充分混合，在1000 r/min下離心5min后，取出100 μ I酯層移入另一支PCR管中，用吹風機吹干，加入100 μ I的去離子水重新溶解，在228nm下測定吸光值。用10 μ I的紫菜多肽原液替換10 μ I的緩沖液，步驟同上，測定吸光值。
[0015](2)ACE抑制率(％)= (A-B+D)/ (A-C) X100%o其中，A為無抑制劑管的吸光值，B為含抑制劑管的吸光值，C為空白對照管的吸光值，D為抑制劑空白管的吸光值。
[0016]實施例1紫菜的預處理
稱取Ikg壇紫菜在50°C下烘2h，得到的干紫菜放入高速粉碎機中粉碎，然后按照質量體積比1:15 (以干紫菜粉重量計)將干紫菜粉加入水中，在4°C下過夜浸泡。再用砂磨機在轉速為2000r/min條件下研磨80min,得到紫菜顆粒勻衆。
[0017]實施例2 二次酶解
稱取64g紫菜顆粒勻衆(內含4g干紫菜粉和60g水，即1:15研磨),加入60mg胰蛋白酶，混合均勻，用lmol/1和0.lmol/1的碳酸鈉溶液調pH至8,在37°C下酶解3h,得到酶解液LI，將酶解液LI在15000Xg、4°C條件下離心30min，得到上清液SI和沉淀物S2。將沉淀物S2加入40ml水中使之重懸，在重懸液中加入40mg堿性蛋白酶(堿性蛋白酶由地衣芽孢桿菌常規發酵而得)，混合均勻，用lmol/1和0.lmol/1的碳酸鈉溶液調pH至8，在50°C下酶解2h，得到得到酶解液L2，將酶解液L2在8000 X g、4°C條件下離心15min，得到上清液S3和沉淀物S4。棄去沉淀物S4，收集、合并上清液SI和S3，得到上清液S5。
[0018]實施例3分離純化
將S5在沸水浴中煮1min滅酶，之后在8000 X g、4°C條件下離心15min，得到上清液S6和沉淀物S7,棄去沉淀物S7,收集上清液S6，即為紫菜多肽原液。
[0019]經測定，紫菜多肽原液中蛋白質含量為1.16%，提取率為71.6%，ACE活性抑制率為 93.3%。
[0020]本發明第一次酶解時間為3小時，第二次酶解時間為2小時，第一次酶解3小時后，本發明人發現生成的紫菜多肽會抑制蛋白酶的水解，即紫菜多肽的產量達到了平穩期，即使再延長酶解時間，紫菜多肽的量也不會再增加，因此，本發明人對第一次酶解的沉淀物進行了第二次酶解，由于該沉淀物基本不含紫菜多肽，因而在第二次酶解中，解除了產物抑制的作用，使得沉淀物中含有的紫菜底物被進一步得以分解利用。
[0021]綜上，本發明人采用二次酶解法，克服產物抑制效應，在相對現有技術縮短反應時間的同時，大大提高了紫菜多肽的提取率。本領域的普通技術人員能從本發明公開內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種紫菜多肽原液的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟一、制備紫菜顆粒勻漿: 以壇紫菜為原料，烘干后用高速粉碎機粉碎，形成干紫菜粉，所述干紫菜粉加水過夜浸泡使之充分溶脹，再用砂磨機進一步研磨，成顆粒細小的紫菜顆粒勻漿； 步驟二、采用二次酶法酶解: 第一次酶解時，將所述紫菜顆粒勻漿作為底物，將蛋白酶按質量百分比1.5%，以所述干紫菜粉重量計，加入所述底物中，調PH至2-9，在35~60°C下酶解3h，得到酶解液LI，將所述酶解液LI在15000Xg、4°C條件下離心30min，得到上清液SI和沉淀物S2 ； 第二次酶解時，按質量體積比1:10，以所述干紫菜粉重量計，將沉淀物S2加入水中使之重懸，得到紫菜懸浮液，將蛋白酶按質量百分比1.0%，以所述干紫菜粉重量計，加入所述紫菜懸浮液中，調PH至2-9，在35~60°C下酶解2h，得到酶解液L2，將所述酶解液L2在8000 X g、4°C條件下離心15min，得到上清液S3和沉淀物S4，棄去所述沉淀物S4，收集、合并所述上清液SI和所述上清液S3，得到上清液S5 ； 步驟三、分離純化: 將所述上清液S5在沸水浴中煮1min滅酶，之后在8000 X g、4°C條件下離心15min，得到上清液S6和沉淀物S7,棄去所述沉淀物S7,收集所述上清液S6，即為紫菜多肽原液。
2.如權利要求1所述的一種紫菜多肽原液的制備方法，其特征在于:所述步驟一中，將所述干紫菜粉按照質量體積比1:15加入水中，在4°C下過夜浸泡。
3.如權利要求1所述的一種紫菜多肽原液的制備方法，其特征在于:所述步驟一中，所述砂磨機的轉速為2000r/min,研磨時間為80min。
4.如權利要求1所述的一種紫菜多肽原液的制備方法，其特征在于:所述的蛋白酶為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶或風味酶以及上述酶的組合。
【專利摘要】本發明公開了一種紫菜多肽原液的制備方法，以壇紫菜為原料，經過烘干、粉碎、加水浸泡、研磨等處理，得到顆粒細小的紫菜顆粒勻漿，加入一定量的蛋白酶二次酶解，得到酶解液，酶解液經滅酶、離心處理后即得紫菜多肽原液。本發明由于采用了二次酶解，使得紫菜得以充分酶解，在縮短酶解時間的同時，大大提高了紫菜多肽原液的提取率。
【IPC分類】C12P21-06
【公開號】CN104694603
【申請號】CN201510077307
【發明人】李健, 蘇文金, 蘇國成, 雷桂潔, 周常義, 劉靜雯
【申請人】集美大學
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月13日