一種南江黃羊GSK-3β基因編碼區(qū)全序列的克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說涉及一種從南江黃羊肝臟組織中克隆GSK_3i3 ( Glycogen synthase kinase-3 beta)基因編碼區(qū)全序列的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)是一種通過自身磷酸化與去磷酸化起到調(diào)控作用，涉及多條通路，其中包括wnt、Hedgehog和IGF-1等重要信號通路的絲/蘇氨酸蛋白激酶。其參與的通路可涉及細(xì)胞分化增殖調(diào)節(jié)，形態(tài)發(fā)育，誘導(dǎo)性神經(jīng)退化疾病如阿爾茨海默病(AD)，糖原代謝病如二型糖尿病(Type II Diabetes)，細(xì)胞有絲分裂，衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化，機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)，癌癥發(fā)生等多個(gè)方面，在醫(yī)學(xué)生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域有重要的影響。GSK-3基因主要有兩個(gè)亞型，即GSK-3a和GSK-3 β。二種亞型在催化區(qū)域具有98%的同源性，于N-和C-末端略有不同。通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，兩種亞型可功能型代償，但依然有所差異:(I) GSK-3 β在心肌細(xì)胞分化，心臟發(fā)育左右對稱性，心臟擺位等過程中起主導(dǎo)作用；在超負(fù)荷壓力下兩種亞型磷酸化表現(xiàn)有所區(qū)別；(2)在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，GSK-30通過調(diào)節(jié)糖原合酶的活性來影響糖原的合成，兩種亞型在肝糖原代謝中作用程度中有一定差異；(3)GSK-3兩種亞型對細(xì)胞分化增殖及心血管發(fā)育影響有所不同；
(4)在腦神經(jīng)發(fā)育方面，GSK-3 β的高表達(dá)與雙向情感障礙(bipolar disorder)、阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease)等相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系更為密切；(5) GSK-3 β在Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，通過該通路對胚胎干細(xì)胞系發(fā)育的作用也有一定差異。目前，除了人與小鼠，GSK-3亞型在其他物種中的相關(guān)研究還非常有限。由此可見，在不同物種中深入探索GSK3-0相關(guān)特性會為相關(guān)病理學(xué)與生理學(xué)研究打下良好的基礎(chǔ)。
[0003]RT-PCR克隆:是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及分子克隆相結(jié)合的一種技術(shù)。首先利用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增我們需要的目的基因片段，然后將此片段與載體連接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆，獲得的質(zhì)粒PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。此技術(shù)利用PCR技術(shù)能在體外進(jìn)行有效的基因擴(kuò)增，而不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，能夠快速獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化法難于得到的PCR產(chǎn)物；同時(shí)該方法能克服普通PCR產(chǎn)物測序引物近端的十幾個(gè)堿基無法測序獲得的缺點(diǎn)。與RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)技術(shù)相比較而言，目的基因片段的長度明確，成本較低，工作量小。該技術(shù)的關(guān)鍵是PCR引物的設(shè)計(jì)，在起始密碼子的上游設(shè)計(jì)正向引物，在終止密碼子的下游設(shè)計(jì)反向引物，使得PCR產(chǎn)物能包含完整的基因編碼區(qū)全序列。
[0004]獲得目的基因編碼區(qū)序列一般采用克隆或RACE技術(shù)，RACE技術(shù)是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段cDNA片段，通過向兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的3’端和5’端。但該技術(shù)與克隆技術(shù)相比，目的基因片段的長度不明確，試驗(yàn)成本高，工作量大，對于提取的RNA質(zhì)量要求較高，因此應(yīng)用相對較少。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單、快速獲取南江黃羊GSK-3 β基因完整編碼區(qū)序列的方法，填補(bǔ)在南江黃羊上該基因研究的空白，為進(jìn)一步研究其在南江黃羊上的功能奠定基礎(chǔ)。
[0006]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種克隆南江黃羊GSK-3 0基因編碼區(qū)全序列的方法，包括以下步驟:
Al、從南江黃羊肝臟組織樣品中提取總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
A2:以綿羊該基因的序列為模板在起始密碼子上游區(qū)域和終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計(jì)引物；
A3:以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
A4:擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收和純化；
A5:純化的產(chǎn)物進(jìn)行克隆與測序，即能得到南江黃羊GSK-3 0基因的編碼區(qū)全序列。
[0007]所述的方法，步驟Al包括以下步驟:取用液氮研磨好的組織粉末約80mg，加入預(yù)先盛有ImL Trizol的EP管中，振蕩混勻后，室溫靜置5min ;加氯仿0.2mL(必須按總體積的1/5)，旋渦儀振蕩混勻15秒，室溫靜置5min ;4°C下12000rpm離心15min ;轉(zhuǎn)移上層水相450μ?于另一個(gè)新的1.5mLEP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置1min ；4°C下12000rpm離心1min ;棄去上層清液后，加入4°C預(yù)冷的75%乙醇(用DEPC處理水配制)ImL,靜置5η?η,4.?下7500g離心5min ;棄上清,用槍吸取多余的液體,空氣干燥約3min ;力口入30μ? DEPC處理水，吹打混勻，充分溶解RNA，然后立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
【附圖說明】
[0008]序列表SEQ ID NO:1,山羊GSK-3 β基因序列。
[0009]圖1是山羊GSK-3 β基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]具體實(shí)施步驟:
1、組織樣的采集
選取出生后120d的南江黃羊進(jìn)行宰殺，取其肝臟組織樣品后迅速置于液氮中保存待用。
[0011]2、總RNA的提取和cDNA的合成
(O取用液氮研磨好的組織粉末80mg,加入預(yù)先盛有ImL Trizol的EP管中，振蕩混勻后，室溫靜直5min ；
(2)加氯仿0.2mL(必須按總體積的1/5)，旋渦儀振蕩混勻15秒，室溫靜置5min ;
[0024](3)4°C下 12000rpm 離心 15min ；
(4)轉(zhuǎn)移上層水相450μ?于另一個(gè)新的1.5mLEP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置1min ；
(5)4°C下 12000rpm 離心 1min ；
(6)棄去上層清液后，加入4°C預(yù)冷的75%乙醇(用DEPC處理水配制)lmL，靜置5min，
(7)4°C下 7500g 離心 5min ；
(8)棄上清，用槍吸取多余的液體，空氣干燥約3min;加入30μ? DEPC處理水，吹打混勻，充分溶解RNA。
[0012](9)用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA的質(zhì)量，效果好的立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0013]3、目的基因片段的擴(kuò)增
(1)引物的設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的綿羊(6￥i5.aries )的GSK-3 β(NMJ)Ol 129740
)基因序列,采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,設(shè)計(jì)的引物為:
正向引物:5’ ATGTCAGGGCGGCCCAGAA 3’
反向引物:5’ GACCAGTGTTGCTGAGTGAC 3’
(2)PCR的反應(yīng)體系和條件:反應(yīng)體系(30μυ: 15 μ?的2XTaq PCR Master Mix，正反向引物各I KL，11.5 μ?的滅菌ddH20，模板cDNA 1.5 μ?。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性4 min,36 個(gè)循環(huán)(95°C，40 s ；62°C,40 s ；72°C,60 s)，最后 72°C 7 min;PCR 產(chǎn)物用 1.5% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。
[0014]4、PCR產(chǎn)物的回收和純化
PCR產(chǎn)物用上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化回收，具體步驟為:
(I)通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，然后用干凈的手術(shù)刀將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊切下，放入1.5 mL離心管中。
[0015](2)稱量凝膠的重量，根據(jù)膠塊的重量和濃度，按每10mg瓊脂糖加400μ?的比例加入 Binding Buffer II。
[0016](3)將離心管置于55 °C金屬恒溫浴中5?10 min,間或混勻，直至膠塊完全溶化。
[0017](4)(可選步驟)當(dāng)目的片段<500bp時(shí),加入所使用的Binding Buffer II 1/3體積的異丙醇混勻。當(dāng)目的片段>500bp時(shí)，此步驟可以省略，直接進(jìn)行步驟(5)。
[0018](5)將溶化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放在2ml收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，室溫放置2 min。8000 rpm室溫離心I min。
[0019](6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，加入 500 M-L Wash Solut1n, 10000 rpm 室溫離心 I min。
[0020](7)重復(fù)步驟(6) —次。
[0021](8)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，12000 rpm 室溫離心 2 min。
[0022](9)將UNIQ-10柱放入一新的1.5 mL離心管中，在吸附膜中央加30 μ? Elut1nBuffer,室溫放置I?2 min。12000 rpm室溫離心I min,離心管中的液體即為回收的DNA片段。
[0023](10)取收集的DNA 2μ?, 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測回收的DNA質(zhì)量。
[0024]4、產(chǎn)物的克隆
(O目的片段與載體連接
將7μ?膠回收產(chǎn)物與2PL PMD19-T載體、?μ?連接酶連接。將載體在冰上融化，短暫離心裝有載體的離心管，以免液體掛在管壁上。在超凈操作臺上配置連接液。將反應(yīng)混合液置于16°C水浴鍋中連接3h。
[0025](2)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
從_80°C冰箱取出保存的感受態(tài)細(xì)胞DH5 α冰浴助融，吸取50μ?加入到ΙΟμ?連接液中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。
[0026]冰上放置30min。
[0027]熱激轉(zhuǎn)化:42°C加熱45 s后，放在冰上I?2min。
[0028]加入預(yù)先保存在37°C的LB培養(yǎng)基800μ?于37°C振搖培養(yǎng)45min。
[0029]室溫下4000g離心1min,吸掉上清液600μ?。
[0030]吸取連接產(chǎn)物到平板上均勻涂布，液體被完全吸收后倒置于37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
12?16 ho
[0031](3)陽性克隆的篩選
用滅過菌的牙簽挑取單個(gè)菌落，接種于含有Amp的800μ? LB培養(yǎng)基中，37 °C，200r/min振蕩培養(yǎng)5 h后吸取I PL菌液作PCR模板，依據(jù)PCR擴(kuò)增的體系和條件進(jìn)行PCR鑒定，產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳來檢測。依據(jù)菌液PCR檢測結(jié)果，吸取含有陽性克隆的菌液600μ?，送往上海立菲生物技術(shù)有限公司廣州測序部進(jìn)行測序。
[0032]將測序結(jié)果使用DNAstar軟件進(jìn)行校對拼接，尋找基因的起始密碼子與終止密碼子，得到的GSK-30基因1333的完整編碼區(qū)序列，經(jīng)比對，所得南江黃羊GSK-30基因編碼區(qū)序列與綿羊一致性達(dá)到99%。
[0033]應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種克隆南江黃羊GSK-3 0基因編碼區(qū)序列的方法，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO:1 所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，擴(kuò)增南江黃羊GSK-3i3基因編碼區(qū)序列的正、反向引物的DNA序列如下所示: 正向引物:5’ ATGTCAGGGCGGCCCAGAA 3’ 反向引物:5’ GACCAGTGTTGCTGAGTGAC 3’。
3.制備如權(quán)利要求1所述的基因片段的方法，按照以下步驟:利用NCBI數(shù)據(jù)庫信息，在線比對牛、綿羊GSK-3 0基因，在保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，提取南江黃羊肝臟組織總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后PCR產(chǎn)物純化和測序，獲得如序列表SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列。
【專利摘要】本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種克隆南江黃羊GSK-3β基因編碼區(qū)全序列的方法。其編碼區(qū)核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明還公開了一種南江黃羊GSK-3β基因克隆的方法，包含以下步驟：步驟一，提取南江黃羊肝臟組織中的總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA；步驟二，擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)；步驟三，擴(kuò)增產(chǎn)物的回收和純化；步驟四，克隆。采用上述方案，本發(fā)明首次獲得了南江黃羊GSK-3β基因完整的編碼區(qū)序列，該發(fā)明也為進(jìn)一步研究南江黃羊GSK-3β基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N15-10, C12N15-54
【公開號】CN104694555
【申請?zhí)枴緾N201310638324
【發(fā)明人】侯郁果, 王林杰, 張紅平, 李利, 仲濤, 王艷
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2013年12月4日