成纖維細胞生長因子抑制多肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及成纖維細胞生長因子抑制多肽及其應用，具體涉及具有抑制成纖維細 胞生長因子，治療惡性腫瘤的多肽。
【背景技術】
[0002] 血管生成是惡性實體腫瘤突破上皮基底膜后進一步生長所必須的。腫瘤中新形成 的血管具有其自身獨特的結構特點，表現為管壁不完整，無平滑肌成分，僅由有孔的內皮細 胞和片狀的基膜構成。多數學者認為，新生血管的結構特點使惡性腫瘤組織發生遠處轉移 成為可能。因此，惡性實體腫瘤中新生血管的定量被認為是一種重要的獨立的預后標志。
[0003] 成纖維細胞生長因子，對腫瘤細胞有明顯的趨向活性，刺激成纖維細胞，血管內皮 細胞等向病灶部位移動。當細胞迀移至病灶部位時，開始進入增殖和修復期，其中最關鍵的 步驟之一是肉芽組織的形成，肉芽組織的本質是大量的毛細血管和豐富的成纖維細胞，是 成纖維細胞、血管內皮細胞及血管平滑肌細胞的高效促生長劑，能夠強烈促進新生毛細血 管的形成，顯著增加肉芽組織毛細血管數量和血液流量，為腫瘤組織提供所需要的氧及豐 富的營養物質，促進腫瘤的生長。抑制成纖維細胞生長因子，可以有效抑制腫瘤組織中血管 的新生，斷絕腫瘤組織生長需要的氧及營養物質，將腫瘤細胞"餓死"。從而，達到治療腫瘤 的效果。
[0004] 目前，沒有成熟開發的成纖維細胞生長因子抑制多肽問世，用于治療惡性腫瘤。
[0005] 本專利中的成纖維細胞生長因子抑制多肽已證明在結腸癌病中有效，具有在其他 腫瘤模型中開發的前景。
【發明內容】
[0006] 發明目的
[0007] 本發明提供全新的序列，該序列為成纖維細胞生長因子拮抗劑，對惡性腫瘤具有 很好的療效。
[0008] 技術方案
[0009] 成纖維細胞生長因子抑制多肽，其特征在于其序列為PSHNPEEQLSWGDSGEDSEPLP。
[0010] 所述的成纖維細胞生長因子抑制多肽在制備治療腫瘤藥物中的應用。
[0011] 所述的成纖維細胞生長因子抑制多肽在制備治療肝癌藥物中的應用。
[0012] 一種檢測腫瘤的試劑盒，其含有權利要求1所述的成纖維細胞生長因子抑制多 肽。
[0013] 所述的試劑盒，其特征在于還有
[0014] (1)包被液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液；
[0015] (2) PBS緩沖液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液；
[0016] (3)抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS 和 0? 2% BSA ;
[0017] (4)封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0% BSA
[0018] (5)洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05% Tween-20 ;
[0019] (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液；
[0020] (7)終止液：2mol/L硫酸溶液；
[0021] (8)成纖維細胞生長因子抗體；
[0022] (9)山羊抗小鼠IgG。
[0023] 有益效果
[0024] 利用固相合成法化學合成成纖維細胞生長因子抑制多肽，該多肽具有全新的序 列，該多肽可體外抑制成纖維細胞生長因子，治療惡性腫瘤，如結腸癌。我們發現的成纖維 細胞生長因子抑制多肽可以同時抑制結腸癌細胞增殖活力，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠 生存率，具有潛在的新藥開發價值。
【具體實施方式】
[0025] 成纖維細胞生長因子抑制多肽由上海生工合成。
[0026] 實施例1
[0027] 成纖維細胞生長因子抑制多肽對體外培養人結腸癌細胞的生長和存活IC50。
[0028] 采用MTT比色法。將對數生長的人結腸癌細胞，以1. 0X 105加入96孔培養板中， 培養24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物成纖維細胞生長因子抑制 多肽（上海生工合成）和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設五個 復孔，培養48h，分別在他、211、811、1411、2011、2411、3611、，4811每孔加入1〇'1'，作用411后，加入 DMSO,孵育30min，在酶標儀620nm處測定吸光度A值，按公式人結腸癌細胞生長抑制率= (1-實驗組吸光值/對照組吸光值）X 100%。計算出實驗藥物的IC50為14. 45 y M，陽性對 照藥的IC50為4. 2yM。
[0029] 實施例2
[0030] 成纖維細胞生長因子抑制多肽對體外培養人肝癌細胞的生長和存活IC50。
[0031] 采用MTT比色法。將對數生長的人肝癌IfepG2細胞，以1. 0X 105加入96孔培養 板中，培養24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物成纖維細胞生長因 子抑制多肽和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設五個復孔，培養 48h，分別在 0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMSO,孵育 30min，在酶標儀620nm處測定吸光度A值，按公式人H印G2細胞生長抑制率=(1-實驗組吸 光值/對照組吸光值）X 100%。計算出實驗藥物的IC50為24. 75 y M，陽性對照藥的IC50 為 4. 9 yM。
[0032] 實施例3
[0033] 用腫瘤模型檢測成纖維細胞生長因子抑制多肽的體內活力。
[0034] 建立結腸癌腫瘤模型，陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑，實驗組 多肽（上海生工合成）設3個劑量：l、2、4mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數量，計算存活 率。結果顯示，成纖維細胞生長因子抑制多肽可有效地保護小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存 率，0? 75、1. 5、3mg/Kg 生存率達到 92. 12%，82. 23%，72. 4%，對應的紫杉醇 42. 2%。
[0035] 實施例4含有成纖維細胞生長因子抑制多肽的ELISA試劑盒檢測：
[0036] 酶連免疫吸附實驗（ELISA)試劑盒包括如下試劑：
[0037] (1)包被液：0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)。稱取0? 75g碳酸鈉，1. 46g碳酸氫 鈉，加去離子水定容至500ml ;
[0038] (2)PBS緩沖液：0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)。稱取0? 2g磷酸二氫鉀，2. 90g 磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，加去離子水定容到1000ml ;
[0039] (3)抗體稀釋液：0? 02mol/LPBS (pH7. 4)和 0? 2% BSA。稱取 0? 2gBSA 加入配好的 0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0040] (4)封閉液：0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)和2. 0% BSA。2. OgBSA加配好的 0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0041] (5)洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05 % Tween-20。將 50ulTween-20 溶入 100ml0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液中，震蕩混勻；
[0042] (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液；
[0043] (7)終止液：2mol/L硫酸溶液。10ml98%濃硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至 100ml，室溫保存；
[0044] (8)成纖維細胞生長因子抑制多肽
[0045] (9)成纖維細胞生長因子抗體購自上海一研生物科技有限公司
[0046] (10)二抗（山羊抗小鼠IgG)購自艾美捷科技有限公司
[0047] 使用方法：1、血清樣本制備：取3只荷瘤裸鼠，進行眼眶取血，每只200 yL，迅速 離心 12000rpm 3min，取上清，按體積比 1 :2 加 PBS，80°C水浴 30min，12000rpm 3min 取上 清，-20°C凍存備用。2、成纖維細胞生長因子抗體為包被抗體，將成纖維細胞生長因子抗體 溶于包被稀釋液中，濃度為100 u g/mL。96孔酶標板每孔加入100 y L，4°C包被過夜。棄去 包被液，加入封閉液200 y L，37°C封閉lh。棄去封閉液，分別加入樣品稀釋液稀釋的血清樣 本100yL(稀釋比1 :50)和成纖維細胞生長因子抑制多肽100yL(10μg/ml)及上述血清 樣本50 y L和成纖維細胞生長因子抑制多肽50 y L的混合物，分成3組，37°C孵育lh。棄去 血清，PBST和自來水間隔洗滌三次。洗滌后，每孔加入樣品稀釋液稀釋酶標二抗100 y L (稀 釋比1 :10000)，37°C孵育lh。棄去二抗，洗滌。洗滌后，每孔加入100yL底物液（50yL底 物A，50yL底物B)，37°C反應30min后，加入50yL 2M H2S0j#止反應，用酶標儀在450nm 波長測定每孔的光密度值〇D45tol。
[0048] 結果：成纖維細胞生長因子抑制多肽可以和成纖維細胞生長因子抗體結合，并可 以競爭血清中成纖維細胞生長因子，故說明成纖維細胞生長因子抑制多肽用競爭法檢測成 纖維細胞生長因子，實現腫瘤預測；
【主權項】
1. 成纖維細胞生長因子抑制多肽，其特征在于其序列為PSHNPEEQLSWGDSGEDSEPLP。
2. 如權利要求1所述的成纖維細胞生長因子抑制多肽在制備治療腫瘤藥物中的應用。
3. 如權利要求1所述的成纖維細胞生長因子抑制多肽在制備治療肝癌藥物中的應用。
4. 一種檢測腫瘤的試劑盒，其含有權利要求1所述的成纖維細胞生長因子抑制多肽。
5. 如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于還有 (1) 包被液：p!19. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液； (2)PBS緩沖液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液； (3) 抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS和 0? 2%BSA; (4) 封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0%BSA (5) 洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05%Tween-20 ; (6) 底物液：可溶性單組份TMB底物溶液； (7) 終止液：2mol/L硫酸溶液； (8) 成纖維細胞生長因子抗體； (9) 山羊抗小鼠IgG。
【專利摘要】本發明成纖維細胞生長因子抑制多肽及其應用；涉及藥物領域，具體涉及具有抑制成纖維細胞生長因子，治療惡性腫瘤的多肽。其序列為PSHNPEEQLSWGDSGEDSEPLP是全新的序列，它們可以在體外抑制結腸癌細胞和肝癌細胞的增殖，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發價值。
【IPC分類】G01N33-574, C07K14-00, A61P35-00, A61K38-16, G01N33-68
【公開號】CN104693287
【申請號】CN201510149302
【發明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月31日