一種Jaggedl激動劑多肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及Jaggedl激動劑多肽及其應用，具體涉及具有促進Jaggedl與Notch 的結合，治療惡性腫瘤的多肽。
【背景技術】
[0002] 腫瘤干細胞是腫瘤中具有自我更新能力并能產生異質性腫瘤細胞的細胞。腫瘤干 細胞對腫瘤的存活、增殖、轉移及復發有著重要作用。從本質上講，腫瘤干細胞通過自我更 新和無限增值維持著腫瘤細胞群的生命力；腫瘤干細胞的運動和迀徙能力又使腫瘤細胞的 轉移成為可能；腫瘤干細胞可以長時間處于休眠狀態并具有多種耐藥分子而對殺傷腫瘤細 胞的外界理化因素不敏感，因此腫瘤往往在常規腫瘤治療方法消滅大部分普通腫瘤細胞后 一段時間復發。
[0003] 研宄發現，腫瘤干細胞中Notch信號表達比正常細胞高，抑制Notch活性后雖然還 有有活性的腫瘤干細胞，但已經不能形成腫瘤.而對照組的腫瘤下細胞能夠形成腫瘤，并 且抑制Notch活性后腫瘤下細胞數量明顯降低。所以Notch信號在腫瘤干細胞形成腫瘤過 程中能夠降低腫瘤干細胞向惡性腫瘤轉變的能力。
[0004] Jaggedl是在哺乳動物中Notch信號轉導通路的配體，Jaggedl和相鄰 細胞的Notch結合后，Notch被蛋白酶體切割，釋放出具有核定位信號的胞質區 ICN(intracellular domain of Notch)，進入細胞核與CLS( -類DNA結合蛋白）結合，調 芐基因表達。提高Jaggedl與Notch的結合親和力，促進Jaggedl與Notch的結合，可以有 效降低腫瘤干細胞的活性，抑制腫瘤的生長，從而達到治療腫瘤的效果。
[0005] 目前，沒有成熟開發的Jaggedl激動劑多肽問世，用于治療惡性腫瘤。
[0006] 本專利中的Jaggedl激動劑多肽已證明在黑色素瘤病中有效，具有在其他腫瘤模 型中開發的前景。
【發明內容】
[0007] 發明目的
[0008] 本發明提供全新的序列，該序列為Jaggedl激動劑，對惡性腫瘤具有很好的療效。
[0009] 技術方案
[0010] Jaggedl激動劑多肽，其特征在于其序列為⑶DCGTGGTCAAAALLPCVD。
[0011] 所述的Jaggedl激動劑多肽在制備治療腫瘤藥物中的應用。
[0012] 所述的Jaggedl激動劑多肽在制備治療黑色素瘤藥物中的應用。
[0013] 所述的Jaggedl激動劑多肽在制備治療肝癌藥物中的應用。
[0014] -種檢測腫瘤的試劑盒，其含有權利要求1所述的Jaggedl激動劑多肽。所述的 試劑盒，其特征在于還有
[0015] (1)包被液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液；
[0016] (2)PBS緩沖液：pH7. 4的0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液；
[0017] (3)抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS 和 0? 2% BSA ;
[0018] (4)封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0% BSA
[0019] (5)洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05% Tween-20 ;
[0020] (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液；
[0021] (7)終止液：2mol/L硫酸溶液；
[0022] (8) Notch 抗體；
[0023] (9)山羊抗小鼠IgG。
[0024] 有益效果
[0025] 利用固相合成法化學合成Jaggedl激動劑多肽，該多肽具有全新的序列，該多肽 可體外促進Jaggedl與Notch的結合，治療惡性腫瘤，如黑色素瘤。我們發現的Jaggedl激 動劑多肽可以同時抑制黑色素瘤細胞增殖活力，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具 有潛在的新藥開發價值。
【具體實施方式】
[0026] Jaggedl激動劑多肽由上海生工合成。
[0027] 實施例1
[0028] Jaggedl激動劑多肽對體外培養人黑色素瘤細胞的生長和存活IC50。
[0029] 采用MTT比色法。將對數生長的人黑色素瘤細胞，以1. 0X 105加入96孔培養板 中，培養24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物Jaggedl激動劑多肽 (上海生工合成）和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設五個復孔， 培養48h，分別在Oh、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h每孔加入MTT，作用4h后，加入DMS0，孵 育30min，在酶標儀620nm處測定吸光度A值，按公式人黑色素瘤細胞生長抑制率=(1-實 驗組吸光值/對照組吸光值）X 100%。計算出實驗藥物的IC50為5. 57 y M，陽性對照藥的 4. 43 y M，說明Jaggedl激動劑多肽具有顯著的抑制腫瘤活性。
[0030] 實施例2
[0031] Jaggedl激動劑多肽對體外培養人肝癌干細胞的生長和存活IC50。
[0032] 采用MTT比色法。將對數生長的人肝癌干細胞，以1. 0X 105加入96孔培養板中， 培養24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物Jaggedl激動劑多肽（上 海生工合成）和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設五個復孔，培 養 48h，分別在 Oh、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMS0，孵 育30min，在酶標儀620nm處測定吸光度A值，按公式人肝癌干細胞生長抑制率=(1-實驗 組吸光值/對照組吸光值）X 100%。計算出實驗藥物的IC50為10. 54 yM;陽性對照藥的 6. 51 yM，說明Jaggedl激動劑多肽具有顯著的抑制腫瘤活性。
[0033] 實施例3
[0034] 用腫瘤模型檢測Jaggedl激動劑多肽的體內活力。
[0035] 建立黑色素瘤腫瘤模型，陽性對照藥物紫杉醇10mg/Kg ;空白組加入相同體積的 溶劑，實驗組多肽設3個劑量：5、10、20mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數量，計算存活率。結 果顯示，Jaggedl激動劑多肽可有效地保護小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，5、10、20mg/Kg， 及陽性組生存率達到依次為99%，91. 1%，85%和56%。說明Jaggedl激動劑多肽具有良 好的安全性。
[0036] 實施例4含有Jaggedl激動劑多肽的ELISA試劑盒檢測
[0037] 酶連免疫吸附實驗（ELISA)試劑盒包括如下試劑：
[0038] (1)包被液：0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)。稱取0? 75g碳酸鈉，1. 46g碳酸氫 鈉，加去離子水定容至500ml ;
[0039] (2)PBS緩沖液：0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)。稱取0? 2g磷酸二氫鉀，2. 90g 磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，加去離子水定容到1000ml ;
[0040] (3)抗體稀釋液：0? 02mol/LPBS (pH7. 4)和 0? 2% BSA。稱取 0? 2gBSA 加入配好的 0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0041] (4)封閉液：0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)和2. 0% BSA。2. OgBSA加配好的 0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0042] (5)洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05 % Tween-20。將 50ulTween-20 溶入 100ml0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液中，震蕩混勻；
[0043] (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液；
[0044] (7)終止液：2mol/L硫酸溶液。10ml98%濃硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至 100ml，室溫保存；
[0045] (8) Jaggedl 激動劑多肽
[0046] (9) Notch抗體（一抗）由上海生工合成。
[0047] (10)二抗（山羊抗小鼠IgG)購自艾美捷科技有限公司
[0048] 使用方法：
[0049] 1、血清樣本制備：取3只荷瘤裸鼠，進行眼眶取血，每只200 yL，迅速離心 12000rpm 3min，取上清，按體積比 1 :2 加 PBS，80 °C 水浴 30min，12000rpm3min 取上 清，-20°C凍存備用
[0050] 2、Notch抗體為包被抗體，將Notch抗體溶于包被稀釋液中，濃度為100 y g/mL。 96孔酶標板每孔加入100 y L，4°C包被過夜。棄去包被液，加入封閉液200 y L，37°C封閉lh。 棄去封閉液，分別加入樣品稀釋液稀釋的血清樣本100 yL(稀釋比1 :50)和Jaggedl激動 劑多肽100 U L (10 y g/ml)及上述血清樣本50 y L和Jaggedl激動劑多肽50 y L的混合物， 分成3組，37°C孵育lh。棄去血清，PBST和自來水間隔洗滌三次。洗滌后，每孔加入樣品稀 釋液稀釋酶標二抗100 U L(稀釋比1 :10000)，37°C孵育lh。棄去二抗，洗滌。洗滌后，每孔 加入lOOyL底物液（50yL底物A，50yL底物B)，37°C反應30min后，加入50yL 2M H2S04 終止反應，用酶標儀在450nm波長測定每孔的光密度值0D45tol。結果Jaggedl激動劑多肽 可以和Notch抗體結合，并可以競爭血清中Notch蛋白，故說明Jaggedl激動劑多肽用競爭 法檢測Notch，實現腫瘤預測；
【主權項】
1. Jaggedl激動劑多肽，其特征在于其序列為⑶DCGTGGTCAAAALLPCVD。
2. 如權利要求1所述的Jaggedl激動劑多肽在制備治療腫瘤藥物中的應用。
3. 如權利要求1所述的Jaggedl激動劑多肽在制備治療黑色素瘤藥物中的應用。
4. 如權利要求1所述的Jaggedl激動劑多肽在制備治療肝癌藥物中的應用。
5. -種檢測腫瘤的試劑盒，其含有權利要求1所述的Jaggedl激動劑多肽。
6. 如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于還有 (1) 包被液：p!19. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液； (2)PBS緩沖液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液； (3) 抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS和 0? 2%BSA; (4) 封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0%BSA (5) 洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05%Tween-20 ; (6) 底物液：可溶性單組份TMB底物溶液； (7) 終止液：2mol/L硫酸溶液； (8) Notch抗體； (9) 山羊抗小鼠IgG。
【專利摘要】一種Jaggedl激動劑多肽及其應用，本發明涉及藥物領域，具體涉及具有促進Jaggedl與Notch的結合，治療惡性腫瘤的多肽。其序列為GDDCGTGGTCAAAALLPCVD是全新的序列，它們可以在體外抑制黑色素瘤細胞和肝癌干細胞的增殖，并在體內試驗中提高荷瘤小鼠生存率，并且作為檢測試劑盒使用，其具有潛在的新藥開發價值。
【IPC分類】G01N33-68, A61P35-00, C07K7-08, A61K38-10, G01N33-574
【公開號】CN104693278
【申請號】CN201510148646
【發明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月31日