能檢測多種新生兒遺傳病的rna探針及基因篩查試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種新生兒遺傳代謝病基因檢測方法。
【背景技術】
[0002] 在人類基因組計劃完成十周年的今天，數百種遺傳病可通過基因測序技術進行診 斷，從而達到預防性干預和個體化治療，減少病人及家屬精神創傷和經濟壓力，延長病患生 存時間的目的。基因診斷帶給臨床醫學的發展革命性變化：癌癥風險預測和癌癥病人個性 化用藥指導；體外受精胚胎的基因篩查和無創產前篩查技術；新生兒及成人遺傳病及其攜 帶者篩查等。
[0003] 根據2011年《中國婦幼衛生事業發展報告》統計，近年來，我國新生兒出生缺陷發 生率呈上升趨勢，由1996年的每萬人中87. 7人，上升到2010年的每萬人中149. 9人，增長 幅度達到70. 9%。2010年醫院檢測的前5位出生缺陷種類是先天性心臟病、多指（趾）、唇 裂、先天性腦積水和神經管缺陷。這些缺陷共占全部出生缺陷的49. 1%。出生缺陷不但是 造成兒童殘疾的重要原因，也日漸成為兒童死亡的主要原因，在全國嬰兒死因中的構成比 順位由2000年的第4位上升至2011年的第2位，達到19. 1%。
[0004] 遺傳性代謝病（inherited metabolic diseases, IMD)又稱為先天性代謝缺陷病 (inborn errors of metabolism, IEM)是因為維持機體正常代謝所必需的某種酶、運載蛋 白、膜或受體等的編碼基因發生突變，使其編碼的產物功能發生改變，而出現相應的實驗室 檢查異常和臨床癥狀的一類疾病 [1]。它涉及氨基酸、有機酸、脂肪酸、尿素循環、碳水化合 物、溶酶體、類固醇等多種物質代謝的異常。該類疾病大多為單基因遺傳病，雖然單一病種 患病率低，但其種類繁多，所以總體發病率較高，總體發病率大約在1/800。我國每年約有 2000萬新生兒，其中約有2. 5萬遺傳性代謝病患兒。
[0005] 遺傳性代謝病可以在新生兒期起病，也可以在成年期發病，常累及全身多個臟器， 常慢性起病，反復急性發作，并隨年齡、性別不同而有明顯的差異。由于MD早期癥狀無特 異性，臨床表現復雜多樣，易與窒息、感染、中毒等獲得性疾病混淆，造成漏診或誤診。這類 疾病發病后常呈進行性加重，如未能早期識別診斷、干預、治療，常導致早期夭折或終身殘 疾，且以神經、智力殘疾為最多，會嚴重影響人口素質，造成家庭和社會的沉重負擔。目前， MD的診斷方法主要有尿顯色分析、枯草桿菌抑制試驗、酶活性測定、氣相色譜-質譜聯用 技術（GC-MS)、串聯質譜聯用技術（MS/MS)、單基因分析等。這些診斷方法用于IMD篩查具 有局限性：（1)普遍通量低，一般一次只能檢測一種，不能滿足IMD可檢出病種的逐年增多， 并且需要對遺傳性代謝病有準確的預判；（2)不同MD的檢測方法各異，樣本多樣，如一些 疾病檢測蛋白水平、而另一些疾病則檢測基因水平，有些疾病需要尿液樣本、而另一些則需 要血液樣本。因此不大適合以此開展大規模的遺傳性代謝病的篩查，亟需要一種能高通量 檢測IMD多種疾病的技術。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供能同時檢測多種新生兒遺傳病的RNA探針、以及 提供相應的能對多種新生兒遺傳代謝疾病體外定性檢測的方法，本發明的檢測方法旨在降 低檢測成本。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種新生兒遺傳代謝疾病基因體外定性檢測 的方法，包括以下步驟：
[0008] 1 RNA探針制備
[0009] 1. 1 RNA探針設計：從NCBI的0MIM數據庫（http://omim. org)獲得22個新生兒 遺傳代謝疾病，43個基因的外顯子區域，如表2所示：
[0010]表 2
[0011]
【主權項】
1. 能同時檢測多種新生兒遺傳病的RNA探針，其特征是：RNA探針的設計方法包括如下 步驟： 1) 、獲得新生兒遺傳代謝疾病所對應基因的外顯子區域； 2) 、制定寡核苷酸設計原則： ① 、每種基因不同轉錄本，通過位置信息均映射到HG19人類標準參考基因組上，選取 能覆蓋所有轉錄本的序列； ② 、設計探針時，避開 RefSeq, Ensembl, CCDS, Gencode, VEGA, SNP, CytoBand 數據庫中 的突變、SNP或插入缺失位點； ③ 、外顯子部分向3'和5'端的內含子中各沿伸IObp ; ④ 、每個探針至少有50%以上的重疊，探針CG含量在40% - 60%之間的覆蓋2倍；CG 含量低于40%或高于60%的，覆蓋3倍； 每條寡核苷酸序列包括三部分：5'末端21bp通用序列、120bp能與基因特異性結合的 序列、3'末端2Ibp通用序列； 通用序列：gtccgaatcgcaccagcgtgttgt 通用序列：gagtgcggctcctcatcgagcagg。
2. 根據權利要求1所述的能同時檢測多種新生兒遺傳病的RNA探針，其特征是：1760 條寡核苷酸序列如表1所示： 表1 色探針序列 體可
3.含有如權利要求1或2所述的RNA探針的試劑盒，其特征是：該試劑盒能同時檢測 多種新生兒遺傳病。
【專利摘要】本發明提供能同時檢測多種新生兒遺傳病的RNA探針、以及提供相應的能對多種新生兒遺傳代謝疾病體外定性檢測的方法，本發明的檢測方法旨在降低檢測成本。具體而言，本發明公開了一種能同時檢測多種新生兒遺傳病的RNA探針，RNA探針的設計方法包括如下步驟：1)、獲得新生兒遺傳代謝疾病所對應基因的外顯子區域；2)、制定寡核苷酸設計原則。本發明的1760條寡核苷酸序列具體如表1所示。本發明還同時提供含有上述RNA探針的試劑盒，該試劑盒能同時檢測多種新生兒遺傳病。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104673925
【申請號】CN201510122883
【發明人】洪旭濤, 余文菁, 譚海芹
【申請人】紹興銳創生物科技有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月19日