用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異檢測的引物SSIV-2a及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異檢測的引物SSIV-2a及其檢 測方法，屬于植物分子遺傳學領域。
【背景技術】
[0002] 作為能量和碳素的重要儲存方式，植物中淀粉的合成是分別在造粉體和葉綠體中 完成的。其中造粉體合成儲藏型淀粉，這些淀粉主要儲藏在植物的種子、塊莖、根等組織中， 是食用或工業用淀粉的主要來源；葉綠體則合成過渡淀粉，而過渡淀粉是調控植物生長發 育的重要因素。白天或光照條件下，植物經光合作用固定二氧化碳合成糖類，并經過一系列 的催化反應最終合成過渡淀粉；夜晚或黑暗條件下，植物通過降解過渡淀粉以提供其生長 所必需的碳素。在不同的光照/黑暗條件下，植物通過調節過渡淀粉合成/降解的速率實 現其正常的生長發育（Bahaji et al. 2014)。因此過渡淀粉的合成/降解對植物的生長速 度及生物產量的形成起著重要的作用。
[0003] 儲藏淀粉和過渡淀粉均以淀粉粒的形式存在于植物體中，而淀粉粒是由直鏈和支 鏈淀粉組成的。直鏈淀粉和支鏈淀粉均以ADP葡萄糖（ADPG)為合成起始底物。在淀粉合酶 (8七3代1187111：1^86,55)的作用下，40?6通過€[-1，4糖苷鍵鏈接形成葡聚糖鏈，進而合成直 鏈淀粉；或進一步在淀粉分支酶/淀粉去分支酶的作用下，通過a -1，6糖苷鍵產生分支，形 成支鏈淀粉。淀粉合酶包含顆粒結合淀粉合酶（granule-bound starch synthase，GBSS)和 可溶性淀粉合酶。不同SS酶在淀粉合成過程中的作用、催化底物及其組織分布各不相同。 GBSS I與淀粉粒緊密結合，主要作用于直鏈淀粉，由waxy基因編碼。而可溶性淀粉合酶部 分存在于質體基質中，部分與淀粉粒結合，催化支鏈淀粉的延伸，且不同SS同工型的特性 和在淀粉合成中的作用各不相同。SS I、SS II、SSIII分別優先延長短鏈OP6-10)、中等鏈 (DP11-24)、長鏈（DP25-35) (Keeling and Myers 2010 ;Zeeman et al. 2010)。以 SS II酶 為例，單子葉植物中有SS II a和SS II b兩種同工酶，SS II a存在于胚乳中，而SS II b分 布于葉片等光合組織中。六倍體禾谷類作物小麥中一個或多個SS II a酶缺失將使較短的 分支鏈（DP6-10)數量增加，中等長度的分支鏈（DP11-24)數量減少（Shimbata等，2005)。
[0004] 對SSIV的功能研宄目前主要集中在擬南芥上，研宄表明SS IV可能在淀粉粒的合 成起始反應中起重要作用（Crumpton-Taylor et al.2013)。擬南芥AtssIV基因功能缺失 突變體的每個葉綠體中僅合成1個大的淀粉粒（Roldan et al.2007)，而AtssIII和AtssIV 基因雙缺失突變的葉綠體中則沒有任何淀粉粒合成，表明SSIV在淀粉粒起始合成和淀粉 累積過程中都起著重要的作用（Szydlowski et al.2009)。白天/光照條件下，AtSSIV基 因的過量表達導致葉片中過渡淀粉增加，而增加的這些淀粉在夜晚/黑暗條件下全部轉換 為植物生長所必需的碳素，從而提高了植株的生長速率。過表達AtSSIV基因的馬鈴薯產量 和塊莖中儲藏淀粉的含量均有顯著提高，分析表明AtSSIV基因表達量的增加使AGP和SuSy 活性增強、酸性轉換酵素活性降低、ADPG含量增加，推測產量及淀粉含量的增加是這一系列 酶活性增強共同作用產生的結果（Gamez-Arjona et al.2011)。
[0005] 小麥的SSIV基因僅在葉片和胚中表達，而不在胚乳中表達（Leterrier et al. 2008)，但SSIV在小麥過渡淀粉或淀粉合成中的作用及其對生長過程甚至產量形成的 影響還沒有深入細致的研宄，創制和挖掘SSIV基因新等位變異及其缺失突變體是研宄 SSIV功能的重要途徑。SSIV蛋白的第422~661位氨基酸序列含有淀粉催化保守域GT-5 和1個高度保守的ADP葡萄糖結合域（Leterrier et al. 2008)，該區域堿基突變將導致基 因功能變異。因此，在上述區域挖掘出SSIV基因新等位變異及其缺失突變體將促進SSIV 功能的深入研宄。
【發明內容】
[0006] 為滿足上述領域的需求，本發明提供一對用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變 異檢測的引物及使用所述引物檢測小麥TaSSIV等位變異的方法。本發明請求保護的技術 方案如下：
[0007] 用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異檢測的引物，其核苷酸序列為：
[0008] SSIV-2a F :5' CTG CAA AAA ATT GTC TAA AAG CTA C 3' ；
[0009] SSIV-2a R :5, CAT GCT TTG AAA TTA TCT ACT TTC G 3，。
[0010] 用于檢測小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異的方法，包括如下步驟：
[0011] ⑴以小麥突變群體為材料，提取基因組DNA;
[0012] (2)混合小麥突變群體中不同株系的基因組DNA，構建樣本池；
[0013] (3)以每個樣本池的基因組DNA為模板，采用權利要求1所述的引物及其熒光引物 進行PCR反應，獲得PCR產物；
[0014] 所述熒光引物為：在權利要求1所述引物的基礎上，在引物SSIV_2a F上添 加IRdye700熒光標記獲得的熒光引物SSIV_2a F IRdye700,在引物SSIV_2a R上添加 IRdye800熒光標記獲得的熒光引物SSIV_2a R IRdye800 ;
[0015] (4)采用特異性限制性內切酶對步驟（3)獲得的PCR產物進行酶切反應，得到酶切 產物；
[0016] (5)進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用Li-C〇r 4300DNA遺傳分析系統檢測步驟 ⑷獲得的酶切產物，得到兩張電泳圖片，A圖包含IRdye700熒光標記，B圖包含IRdye800 熒光標記；
[0017] (6)若A圖中DNA片段大小與B圖中DNA片段大小的和等于1361bp，即可初步判 斷該片段所來自的樣本池中含有特異酶切片段，即等位變異；
[0018] (7)以初步判斷含有特異酶切片段的樣本池的原始樣本基因組DNA為模板，采用 權利要求1所述的引物進行PCR反應、測序驗證所述等位變異。
[0019] 所述混合指將誘變群體中不同株系的基因組DNA兩兩等量混合。
[0020] 所述權利要求1所述的引物及其熒光引物的混合比例為：SSIV_2a F:SSIV_2a F IRdye700:SSIV-2a R:SSIV-2a R IRdye800 = 4:1:1:4〇
[0021] 所述特異性限制性內切酶是CELI酶，所述酶切反應的條件為45°C酶切15min。
[0022] 所述 PCR 反應的 10 y 1 體系為：10XBuffer 0? 5 y 1 ;1. 5mmol/L Mg2+;0. 2mmol/L dNTP ;0. 25mmol/L 引物；高保真 DNA 聚合酶 0. 5U ;200ng 模板 DNA。
[0023] 所述PCR反應的程序為：95°C預變性5min ;94°C變性30s，64°C退火30s，以0. 5°C/ s的速度升至72°C并延伸lmin，8個循環，每循環的退火溫度比上一循環降低1°C ;94°C變性 30s，56°C退火30s，以0. 5°C /s的速度升至72°C并延伸lmin，35個循環；72°C總延伸5min ; 99°C變性lOmin ;70°C退火20s，70個循環，每循環的溫度比上一循環降低0. 3°C。
[0024] SSIV蛋白的第422~661位氨基酸序列含有淀粉催化保守域GT-5和1個高度 保守的ADP葡萄糖結合域，該區域的堿基突變將導致基因功能變異。由于普通小麥為六倍 體，而該區域又高度保守，為檢測小麥該區域的突變體，只有設計篩選出特異性極好的引物 進行PCR電泳，才能將發生的等位突變的同源染色體與其它同源染色體區分開來，從而擴 增到可通過凝膠電泳及測序的方法檢測出的等位突變。本發明經過設計和篩選，提供一對 用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異檢測的引物，所述引物的擴增區域為TaSSIV基因 的第6~10外顯子和第6~9內含子區的完整序列，擴增片段長度為1361bp，退火溫度為 56°C，其核苷酸序列為：SSIV-2a F :5' CTG CAA AAA AIT GTC TAA AAG CTA C 3' ；SSIV-2a R:5' CAT GCT TTG AAA TTA TCT ACT TTC G 3'。試驗數據證明，該引物能特異地檢測到 TaSSIV等位突變，如實施例2,圖2和圖3所示，可有助于小麥SSIV的功能研宄。
[0025] 所述等位變異指與野生型相比，淀粉合酶基因TaSSIV發生了單堿基突變如轉換 或顛換，或者發生了小于10個堿基的小片段插入或缺失。
[0026] 本發明還提供一種用于檢測小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異的方法，利用該 方法能夠準確地從小麥突變群體中檢測出TaSSIV等位變異位點。所述小麥突變群體可以 是小麥干種子經EMS(甲基磺酸乙酯）溶液處理后構建的誘變群體，也可以是自然產生的或 以其它本領域公知的誘變方式（例如疊氮化鈉誘變）產生的突變群體。利用EMS誘變小麥， 優選含0. 7~1. 5% EMS的0. 1M磷酸緩沖液（pH7. 0)，根據所需等位變異的多少可對EMS 的濃度進行調整，濃度越高所獲得的等位變異越多。所述誘變群體的大小可根據所需等位 變異的多少進行調整，群體越大所獲得的等位變異越多。種子經EMS溶液處理后種植獲得 Mdf，植株抽穗后套袋自交獲得M 2代種子，將M2代