櫻花品種“咲耶姬”的分子特異性標記引物及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及櫻花品種"咲耶姬"的分子特異性標記引物以及利用該分子特異性標 記引物對櫻花品種"咲耶姬"進行快速鑒定的方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 櫻花隸屬于薔薇科（Rosaceae)櫻屬（Cerasus)，是世界著名的觀賞植物。目前已 知櫻花品種有300多個，因其株型優美、花色艷麗、整個花期延續期長，在園林上有極大的 應用價值。近年來，我國各地大規模種植櫻花并應用于公園、學校、街道、庭院等綠地中，成 為早春主要觀賞花木之一。北京、武漢、青島、上海等城市每年紛紛舉辦櫻花節，櫻花產業得 到迅猛發展，這對于建設美麗中國，促進農民增收，推進山區綜合開發和建設社會主義新農 村，都具有十分重要的意義。
[0003] 我國櫻屬植物資源豐富，分布廣泛，且櫻屬植物表型具有較強可塑性，種間雜交容 易，品種數量眾多，有些品種間性狀差異較小，傳統形態分類很難快速、準確有效評價與區 分。學術界對目前種植櫻花品種的名稱和描述都很混亂，"同物異名"或"同名異物"現象較 為嚴重，缺乏統一規范的名稱及科學系統的分類體系，不便于品種鑒定、推廣、交流及新品 種的培育，因此亟需建立一個科學合理的櫻花品種分類鑒定系統。
[0004] 目前就全國范圍內的櫻花品種調查和分類還僅僅是通過傳統的形態學特征、過氧 化物酶和酯酶同工酶技術、電鏡掃描花粉粒和Q型聚類分析等方法，這些方法盡管有用，但 很難對櫻花品種進行正確的鑒定和應用。而近年來在植物分類界已廣泛應用的DNA分子標 記技術迄今尚未在櫻花品種分類、品種間親緣關系及遺傳多樣性等研宄上得以應用。因此， 有必要利用分子標記技術手段，對我國現有的櫻花品種進行科學鑒別，不僅有助于櫻花品 種分類鑒定系統的建立，也為櫻屬植物資源的進一步研宄提供分子依據。
[0005] 目前國內引進大量的櫻花品種，在北京、青島、武漢、上海等各大公園內廣泛栽植， 觀賞價值極高，其中以晚櫻品種居多，普遍具有花量大、花色艷麗、花瓣多、花期長、抗性 強、適應性廣等特點。我們經過長期的調查工作，發現20個晚櫻品種包括紅笠（Cerasus serrulata'Benigasa'）、紅華（C. serrulata'Kouka'）、一葉（C. serrulata'Hisakura'）、福 綠壽（C. serrulata'Conto;rta'）、普賢象（C. serrulata'Alb〇-;rosea'）、松月（C. serrulata 'Superba'）、郁金（C. serrulata 'Grandifora'）、紅豐（CerasusXsieboldii 'Beni -yutaka'）、御衣黃(C. serrulata 'Gioiko'）、關山(C. serrulata 'Kanzan'）、大提 燈（C. serrulata 'Ojochin'）、八重紅枝垂（C. spachiana 'Plena Rosea'）、市原虎 尾（C. serrulata 'Albo Plena'）、咲耶姬（Cerasus Xyedoensis 'Sakuyahime'）、 朱雀（C. serrulata 'Shujaku'）、楊貴妃（C. serrulata 'Mollis'）、雨情枝垂 (C. spachiana 'Ujou-shidare'）、菊垂樓（C. serrulata 'Plena-pendula'）、平野妹背 (C. serrulata 'Imose'）、旭山樓（C. serrulata 'Asahiyama'）在園林中的應用極其廣泛， 但這些品種的"同名異物"、"同物異名"現象也異常嚴重，從表型特征方面很難鑒別，給園林 植物應用、推廣以及新品種選育帶來很多困難，因此著力從分子水平上開發出這些品種穩 定、特異的DNA指紋標記才是實現櫻花品種準確快速鑒定的科學途徑。 (三）
【發明內容】
[0006] 本發明目的是提供櫻花品種"咲耶姬"的分子特異性標記引物，以及利用該對引物 對櫻花品種"咲耶姬"進行快速鑒定的方法。
[0007] 本發明采用的技術方案是：
[0008] 櫻花品種"咲耶姬"的分子特異性標記引物，所述引物序列為：
[0009] 上游引物：5，-TGAGTCCAAACCGGACCGAGAAG-3，；
[0010] 下游引物：5' -GACTGCGTACGAAITGACGGGAAT-3 '。
[0011] 該引物對是采用PCR技術，經過大量篩選試驗獲得櫻花品種"咲耶姬"的特異性 DNA片段之后，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎設計特異性引物，以該特異性 引物對櫻花品種進行PCR擴增，僅"咲耶姬"可獲得491bp大小的特異性片段，其他櫻花品 種均不能獲得特異性片段。需要說明的是，本發明分子特異性標記引物僅限于櫻花品種的 鑒定（鑒定其是否為"咲耶姬"），即待測樣品僅限于櫻花。
[0012] 本發明還涉及一種利用所述的分子特異性標記引物對櫻花品種"咲耶姬"進行快 速鑒定的方法，所述方法為：提取待測櫻花品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子 特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現 491bp大小的DNA條帶，則待測櫻花品種為櫻花品種"咲耶姬"，反之則否；所述分子特異性 標記引物序列為：
[0013] 上游引物：5，-TGAGTCCAAACCGGACCGAGAAG-3，；
[0014] 下游引物：5' -GACTGCGTACGAAITGACGGGAAT-3 '。
[0015] 本發明方法關鍵在于擴增引物的選擇、DNA提取、PCR反應體系及反應條件確定， 以及電泳檢測，均可按照本領域常規方法進行。
[0016] 優選的，本發明所述PCR擴增體系組成如下：
[0017]
[0018]
[0019] 余量為 ddH20。
【主權項】
1. 櫻花品種"咲耶姬"的分子特異性標記引物，所述引物序列如下： 上游引物：5 ' -TGAGTCCAAACCGGACCGAGAAG-3 ' ； 下游引物：5' -GACTGCGTACGAATTGACGGGAAT-3'。
2. -種利用權利要求1所述的分子特異性標記引物對櫻花品種"咲耶姬"進行快速鑒 定的方法，所述方法為：提取待測櫻花品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性 標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現491bp 的特異DNA條帶，則待測櫻花品種為櫻花品種"咲耶姬"，反之則否；所述分子特異性標記引 物序列為： 上游引物：5 ' -TGAGTCCAAACCGGACCGAGAAG-3 ' ； 下游引物：5' -GACTGCGTACGAATTGACGGGAAT-3'。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件如下：95°C預變性3min ; 95°C變性40s，57°C退火40s，72°C延伸2min，共35個循環；最后于72°C補平7min，終止溫 度為4°C。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： (1) 取待測櫻花葉片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測櫻花葉片的基因組DNA ; (2) 以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物， 進行PCR擴增： PCR擴增體系每25 μ L組成如下： PCR擴增條件如下：
95°C預變性3min ;95°C變性40s，57°C退火40s，72°C延伸2min，共35個循環；最后于 72°C補平7min，終止溫度為4°C ; (3) 取步驟（2)擴增產物5 μ L，與1 μ L0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1. 5%的瓊脂 糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結束后EB染色，于自動凝膠圖像分 析儀上照相，若電泳結果出現491bp的DNA條帶，則待測櫻花品種為"咲耶姬"，反之則否。
【專利摘要】本發明涉及一對特異性高的櫻花品種“咲耶姬”的分子特異性標記引物，以及一種能對櫻花品種“咲耶姬”進行快速鑒定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-TGAGTCCAAACCGGACCGAGAAG-3′；下游引物：5′-GACTGCGTACGAATTGACGGGAAT-3′。本發明分子特異性標記引物可對櫻花品種“咲耶姬”進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別櫻花品種所不能替代的分子手段。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104673913
【申請號】CN201510078432
【發明人】柳新紅, 徐梁, 李海波, 王青華, 趙慶杰, 郭佳, 余建國
【申請人】浙江省林業科學研究院
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月13日