一種利用通用引物多重pcr技術檢測轉基因番木瓜的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種利用通用引物多重PCR技術檢測轉基因 番木瓜的方法。
【背景技術】
[0002] 番木瓜是我國重要的熱帶、亞熱帶優質水果，主要在云南、海南、廣東、福建、廣西、 臺灣等省區種植，不僅可以食用，還具有極其重要的工業應用價值。但由于病害嚴重，特別 是番木瓜環斑病毒Papaya ring spot virus(PRSV)病，導致其品質下降，產量降低，極大地 影響了番木瓜在市場的經濟效益。20世紀90年代初，Fitch等把編碼PRSV衣殼蛋白（Coat prote in，CP)基因轉入番木瓜，獲得了轉CP基因的抗病品系，并于1997年獲準進入商品化 生產，在美國夏威夷廣泛種植。但該品系對我國華南地區、臺灣地區以及泰國等亞洲國家的 PRSV株系無抗性效果。華南農業大學植物病毒研宄室通過轉番木瓜環斑病毒（papaya ring spot virus，PRSV)廣東地區優勢株系Ys復制酶（R印）基因的方法，獲得了高度抗PRSV的 轉基因番木瓜植株"華農一號"，并于2004年獲準進行環境和食用安全評價，2006年獲得農 業部頒發的"轉基因番木瓜華農一號在廣東省應用"的安全證書[農基安證字（2006)第001 號]，這是我國第1例獲準進行商品化的轉基因果樹作物，已進入市場進行商業化生產。
[0003] 基于轉基因食品潛在安全的不確定性，世界各國政府都加強對轉基因食品進行 管理，以保障本國消費者的知情權。目前國內外對轉基因作物進行檢測，檢測技術綜合起 來主要有兩大類型：一是基于轉入的外源基因核酸水平上的檢測；二是基于轉入外源基 因表達產物蛋白質水平上的檢測。國際上普遍采用以核酸為基礎的PCR聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction，PCR)定性檢測技術作為檢測標準。
[0004] 隨著轉基因技術的迅猛發展，轉基因作物的種類日益增多，品種達100多個，由轉 基因作物加工的食品和食品成分達4000多種，其外源基因成分也越來越復雜，需要同時對 多個可能基因進行檢測，檢測任務逐漸增多，因此迫切需要研宄開發出一種準確、快速、簡 便的多基因檢測技術。但傳統的多重PCR技術反應體系往往過于復雜，引物間存在排斥和 抑制反應，以至于結果重復性不夠好，一定程度上限制其高通量性。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是，為了克服傳統多重PCR技術體系復雜、引物間排 斥以及重現性差等缺陷，提供一種利用通用引物多重PCR技術檢測轉基因番木瓜的方法。 該方法借助一條通用引物的以降低每條特異性引物的用量，可以克服傳統多重PCR的引物 間排斥、重現性差等缺點。
[0006] 本發明所要解決的上述技術問題通過以下技術方案予以實現：
[0007] 一種利用通用引物多重PCR技術檢測轉基因番木瓜的方法，包含如下步驟：
[0008] S1.設計1對通用引物和5對接有通用引物的特異性引物，所述引物的序列分別 為：
[0009]Uni-Papain-F：CCTTCCTTCCTTCCACGCAATCTACAATCTTGCTAACCCTA；
[0010] Uni-Papain-R：CCTTCCTTCCTTCCACGCAAGTCATCTTGAGAATAACCCAC；
[0011] Uni-35s-F：CCTTCCTTCCTTCCACGCAAAGACGATCTACCCGAGCAA；
[0012] Uni-35s-R：CCTTCCTTCCTTCCACGCAGAAGCAAGCCTTGAATCGTC；
[0013] Uni-Nptll-F ：CCTTCCTTCCTTCCACGCACTGTGCTCGACGTTGTCACT ；
[0014] Uni-Nptll-R ：CCTTCCTTCCTTCCACGCACTTCCATCCGAGTACGTGCT ；
[0015] Uni-RP-F ：CCTTCCTTCCTTCCACGCACTTTGGTGCGGAAAAGTTGT ；
[0016] Uni-RP-R：CCTTCCTTCCTTCCACGCACCATAGCCCACAGTCGAATT；
[0017] Uni-CP-F：CCTTCCTTCCTTCCACGCAAGAATGTTTGGAATGGACGG ；
[0018] Uni-CP-R：CCTTCCTTCCTTCCACGCAGCATACCCAGGAGAGAGTGC ；
[0019] Universal-primer ：CCTTCCTTCCTTCCACGCA ；
[0020] S2.檢測：以待檢測番木瓜基因組DNA為模板，在PCR反應中加入SI.設計的所有 引物，進行PCR、電泳，從而得知所檢測的番木瓜是否為轉基因番木瓜。
[0021] 優選地，S2.中所述的PCR反應，其反應條件為：預變性94°C，3min ;30個循環：變 性 94°C，30sec，退火 62°C，30sec，延伸 72°C，lmin ;終止延伸 72°C，5min〇
[0022] 優選地，S2.中所述的PCR反應，其反應體系為30yL，含有2XMasterMix ;引物 Uni-Papain-F 和 Uni-Papain-R 為 0? 15 y L，引物 Uni-35s-F 和 Uni-35s-R 為 0? 2 y L，引 物 Uni-NptII-F 和 Uni-NptII-R 為 0? 4 y L，引物 Uni-RP-F 和 Uni-RP-R 為 0? 3 y L，引物 Uni-CP-F和Uni-CP-R為0? 3 y L，通用引物Universal-primer為6 y L，各引物的濃度為 10 y M ;DNA 模板為 6 y L，濃度為 20ng/ y L。
[0023] 優選地，S2.中使用的電泳為瓊脂糖凝膠電泳。
[0024] 更優選地，所述的瓊脂糖凝膠電泳的方法為：取5yL PCR產物于質量體積比為 2%的瓊脂糖凝膠，1 XTAE緩沖液中，穩壓80V電泳30min。
[0025] 所述的方法，能同時對"Event 55-1"、"GM-YK"和"華農一號"三種轉基因番木瓜 進行檢測。
[0026] 優選地，所述的多重PCR技術為五重PCR技術。
[0027] 有益效果：（1)本發明首次成功開發了采用通用引物多重PCR技術檢測轉基因番 木瓜；（2)本發明通用引物可提高多重PCR的擴增效率，大大地提高檢測的靈敏度，同時還 具備多重PCR減低檢測成本的優點，在轉基因番木瓜的檢測的應用上來說，通用引物多重 PCR技術具有很高的可行性；（3)本發明通用引物多重PCR的檢測限為O.OOlng，目標DNA或 者更低，比普通引物的多重PCR效果提高了二個數量級以上。
【附圖說明】
[0028] 圖1為通用引物及特異性引物（帶接頭）單重PCR特異性驗證結果分析圖。其中， 圖中各條帶對應的情況為：1.引物CP;2.引物35S;3.引物NPTII;4.Papain引物；5. RP引 物，6.帶接頭引物CP;7.帶接頭引物35S;8.帶接頭引物NPTII;9.帶接頭Papain引物； 19.帶接頭 RP ;M. Marker。
[0029] 圖2為通用引物多重PCR的驗證圖。其中，圖中各條帶對應的情況為：1.轉基因番 木瓜華農一號（帶接頭Papain引物）；2?轉基因番木瓜"華農一號"（帶接頭35s引物）； 3.轉基因番木瓜"華農一號"（帶接頭35s引物和NtpII213引物）；4.轉基因番木瓜"華 農一號"（帶接頭Papain引物、35s引物和NtpII213引物）；5.轉基因番木瓜GM-YK(含CP 基因）（五種引物）；6.轉基因番木瓜"華農一號"（含RP基因）（五種引物）；7轉基因番 木瓜GM-YK和"華農一號"混合（五種引物）；8空白；M Marker。
[0030] 圖3為通用引物多重PCR靈敏度分析圖。其中，圖中各條帶對應的情況為：
[0031] 1?華農一號 100ng，GM-YK 100ng;2?華農一號 10ng，GM-YK 100ng;3?華農一號 lng，GM-YK 100ng;4?華農一號 0?lng，GM-YK 100ng;5?華農一號 0?Olng，GM-YK 100ng; 6?華農一號 〇? 〇〇lng，GM-YK 100ng;7?空白對照；M. Mark。
【具體實施方式】
[0032] 本實施方式實施例中采用的通用引物單重或多重PCR技術檢測轉基因番木瓜的 方法如下：
[0033] (1)待測試樣品DNA的提取與純化
[0034] 采用三種轉基因番木瓜（Event 55-l、GM-YK和華農一號）和普通番木瓜（臺農2 號）的新鮮葉片，取每種品種的新鮮番木瓜葉約l〇〇mg，加入液氮充分研磨，用DNA提取試劑 盒提取各樣品的DNA。紫外分光光度法來測定DNA提純的濃度和純度。
[0035] (2)引物設計
[0036] 1對通用引物和5對接有通用引物的特異性引物的序列如表1所示：
[0037] 表1檢測轉基因番木瓜內、外源基因的PCR引物
[0038]
【主權項】
1. 一種利用通用引物多重PCR技術檢測轉基因番木瓜的方法，其特征在于，包含如下 步驟：
51. 設計1對通用引物和5對接有通用引物的特異性引物，所述引物的序列分別為： Uni-Papain-F ：CCTTCCTTCCTTCCACGCAATCTACAATCTTGCTAACCCTA ； Uni-Papain-R ：CCTTCCTTCCTTCCACGCAAGTCATCTTGAGAATAACCCAC ； Uni-35s-F ：CCTTCCTTCCTTCCACGCAAAGACGATCTACCCGAGCAA ； Uni-35s-R ：CCTTCCTTCCTTCCACGCAGAAGCAAGCCTTGAATCGTC ； Uni-Nptll-F ：CCTTCCTTCCTTCCACGCACTGTGCTCGACGTTGTCACT ； Uni-Nptll-R ：CCTTCCTTCCTTCCACGCACTTCCATCCGAGTACGTGCT ； Uni-RP-F ：CCTTCCTTCCTTCCACGCACTTTGGTGCGGAAAAGTTGT ； Uni-RP-R ：CCTTCCTTCCTTCCACGCACCATAGCCCACAGTCGAATT ； Uni-CP-F ：CCTTCCTTCCTTCCACGCAAGAATGTTTGGAATGGACGG ； Uni-CP-R ：CCTTCCTTCCTTCCACGCAGCATACCCAGGAGAGAGTGC ； Universal-primer ：CCTTCCTTCCTTCCACGCA ；
52. 檢測：以待檢測番木瓜基因組DNA為模板，在PCR反應中加入SI.設計的所有引物， 進行PCR、電泳，從而得知所檢測的番木瓜是否為轉基因番木瓜。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S2.中所述的PCR反應，其反應條件為：預 變性94°C，3min ;30個循環：變性94°C，30sec，退火62°C，30sec，延伸72°C，lmin ;終止延伸 72〇C,5min〇
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S2.中所述的PCR反應，其反應體系 為 30 y L，含有 2XMasterMix ;弓丨物 Uni_Papain_F 和 Uni_Papain_R 為 0? 15 y L，弓丨物 Uni-35s-F 和 Uni-35s-R 為 0? 2 y L，引物 Uni-NptII-F 和 Uni-NptII-R 為 0? 4 y L，引 物 Uni-RP-F 和 Uni-RP-R 為 0? 3 y L，引物 Uni-CP-F 和 Uni-CP-R 為 0? 3 y L，通用引物 Universal-primer為6 y L,各引物的濃度為10 yM ;DNA模板為6 y L，濃度為20ng/ y L。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，S2.中使用的電泳為瓊脂糖凝膠電泳。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，瓊脂糖凝膠電泳的方法為：取5yL PCR產 物于質量體積比為2%的瓊脂糖凝膠，1乂14￡緩沖液中，穩壓80￥電泳3〇1^11。
6. 根據權利要求1~5任一項所述的方法，其特征在于，能同時對"Event 55-1"、 "GM - YK"和"華農一號"三種轉基因番木瓜進行檢測。
【專利摘要】本發明涉及生物技術領域，具體公開了一種利用通用引物多重PCR技術檢測轉基因番木瓜的方法。該方法包含如下步驟：S1.設計1對通用引物和5對接有通用引物的特異性引物；S2.檢測：以待檢測番木瓜基因組DNA為模板，在PCR反應中加入S1.設計的所有引物，進行PCR、電泳，從而得知所檢測的番木瓜是否為轉基因番木瓜。該方法可提高多重PCR的擴增效率，大大地提高檢測的靈敏度，同時還具備多重PCR減低檢測成本的優點，在轉基因番木瓜的檢測的應用上來說，通用引物多重PCR技術具有很高的可行性。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104673908
【申請號】CN201510075452
【發明人】白衛濱, 孫建霞, 胡云峰, 吳實, 李國強
【申請人】暨南大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月12日