一種肝癌基因ndc80及其應用

            文檔序號:8355781閱讀:386來源:國知局
            一種肝癌基因ndc80及其應用
            【技術領域】
            [0001]本發明涉及生物基因工程技術領域,具體涉及一種肝癌基因NDC80及其應用。
            【背景技術】
            [0002]原發性肝癌(HCC)是常見的惡性腫瘤,其發生率和死亡率分別占全球惡性腫瘤的第5位和第3位1,占我國惡性腫瘤的第3位和第2位,在部分地區和農村其死亡率已經上升到第一位。在全球范圍內其發病率逐年上升,每年約新增加60余萬病例,其中50%以上病例發生在中國。肝炎病毒感染是肝癌的主要危險因素,高達80%的肝癌歸因于乙肝病毒或丙型肝炎病毒感染。在我國,則主要是乙肝病毒感染為主,90%肝癌患者有HBV感染或者HbsAg陽性。但是,目前對于乙肝病毒導致肝細胞癌變的具體機制并不清楚,因此,尋找并確定一種表達肝癌的基因,對于研究肝細胞癌變的具體機制、制定預防或治療肝癌的方法有重要意義。

            【發明內容】

            [0003]本發明的目的在于提供一種肝癌基因。
            [0004]本發明的另一個目的是提供一種肝癌基因的應用。
            [0005]為了實現上述目的,本發明是通過以下方案予以實現的:
            一種肝癌基因NDC80,其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。該基因的登錄號為NC_000018.10。
            [0006]發明人研究發現乙肝病毒感染肝細胞后,導致NDC80上調,上調后NDC80進一步使乙肝病毒繼續擴增,從而形成正反饋,最終,高表達的NDC80促使肝細胞增殖癌變,引起肝癌發生。因此,本發明首次確定NDC80是乙肝病毒感染導致肝癌發生的關鍵因子。
            [0007]在確定NDC80基因為乙肝病毒感染導致肝癌發生的關鍵因子后,本發明同時保護NDC80基因在作為預防或治療乙肝病毒性肝癌的基因靶點中的應用。
            [0008]進一步地,本發明還要求保護一種防或治療乙肝病毒性肝癌的制劑,該試劑含有定量的抑制NDC80基因的抑制劑。
            [0009]與現有技術相比,本發明具有以下有益效果:
            本發明通過研究首次發現NDC80是乙肝病毒感染導致肝癌發生的關鍵因子。首先,乙肝病毒感染肝細胞后,導致NDC80上調,上調后NDC80進一步使乙肝病毒繼續擴增,從而形成正反饋,最終,高表達的NDC80促使肝細胞增殖癌變,引起肝癌發生。該基因有助于進一步了解癌癥機制,為肝癌的防治提供新思路及策略。
            【附圖說明】
            [0010]圖1.相對正常肝組織,癌基因NDC80在原發性肝癌(HBV-)中表達上調,在原發性肝癌(HBV+)上調更加明顯。
            [0011]圖2.干擾NDC80能抑制乙肝病毒活性。
            [0012]圖3.干擾NDC80能明顯抑制肝癌細胞的增殖。
            【具體實施方式】
            [0013]下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容,但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下,對本發明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換,均屬于本發明的范圍,若未特別指明,實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
            [0014]實施例中所述HBV陰性肝癌是指非乙肝病毒性肝癌,HBV陽性肝癌是指乙肝病毒性肝癌。
            [0015]實施例1
            一、免疫組織化學染色:分別對正常肝組織、HBV陰性肝癌組織、HBV陽性肝癌組織進行染色觀察,詳細步驟如下:
            1.標本來源:分別從正常肝組織、HBV陰性肝癌組織、HBV陽性肝癌組織處收集得到用石蠟包埋的組織塊,在顯微鏡下用薄片切片機將所有的組織塊切成4_的薄片,制成玻片;
            2.脫蠟、水化:組織薄片在二甲苯中脫蠟后,再依據標準操作步驟利用分級的酒精(無水、95%、70%)將其水化;
            3.抗原修復:將組織浸泡在EDTA(pH=8.0)中,在121°C下高壓蒸汽處理5min,再用PBS沖洗3次,每次5min ;
            4.滅活酶:將經PBS沖洗后的組織放入3%的過氧化氫中,在室溫下孵育15min,以阻斷內源性過氧化物酶的活性;
            5.抗原-抗體反應:在每張組織薄片上滴加一抗(以含有0.5%的BSA的PBS為稀釋劑,NDC80抗體(sc-135934)按照1:100稀釋),在4°C下孵育過夜,然后用緩沖液沖洗,除去游離抗體;
            6.滴加二抗試劑(生物素化二抗工作液),加PBS反應30min;
            7.使用試劑盒顯色;
            8.與蘇木精進行對比染色,再依次序在酒精和二甲苯中脫水;
            9.以PBS代替一抗作為陰性對照。
            [0016]染色結果見圖1中的A圖,由免疫組織化學染色結果可知:正常肝組織很少表達NDC80蛋白,HBV陰性肝癌組織表達中等,HBV陽性肝癌組織表達最多。
            [0017]二、Western Blot 分析
            利用商品化的試劑盒提取正常肝組織,HBV陰性肝癌組織和HBV陽性肝癌組織的蛋白,提取步驟按照試劑盒說明操作,粗略步驟如下:
            1.將正常肝組織,HBV陰性肝癌組織和HBV陽性肝癌組織剪碎后置入裂解液中進行富集(HBV陽性肝癌組織設為實驗組,HBV陰性肝癌組織,正常肝組織設為對照組,),加入
            0.5mM原鑰;酸鈉、ImM PMSF、lmg/ml抑肽酶、2ug/ml亮抑肽酶;
            2.將裂解物于4°C下HOOOrpm離心1min;
            3.將從癌癥或非癌癥組織中勻漿提取的組織樣品加入到緩沖液中,加入0.2mM PMSF,lug/ml抑肽酶、lug/ml亮抑肽酶;
            4.BCA試劑盒測定步驟3得到的各種上清液的蛋白濃度,并加入SDS-PAGE凝膠電泳進行 western blot 實驗。
            western blot檢測結果見圖1中的B圖,由western blot檢測結果可知:正常肝組織很少表達NDC80蛋白,HBV陰性肝癌組織表達中等,HBV陽性肝癌組織表達最多。
            [0018]三、qRT-PCR定量分析
            利用商品化的RNA提取試劑盒分別提取正常肝組織、HBV陰性肝癌組織、HBV陽性肝癌組織的RNA,然后用商品化的RT-PCR試劑盒定量分析各種組織的RNA,檢測RNA含量所用PCR引物如下:
            F:5’ -CCTCTCCATGCAGGAGTTAAGA-3’ ;
            R:5’ -GGTCTCGGGTCCTTGATTTTCT-3’ ;
            GAPDH-F:5, -GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3,;
            GAPDH-R-R:5’ -GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’ ;
            RT-PCR的操作步驟按照RT-PCR試劑盒操作進行,檢測結果見見圖1中的C圖,由RT-PCR檢測結果可知:正常肝組織很少表達NDC80 mRNA, HBV陰性肝癌組織表達中等,HBV陽性肝癌組織表達最多。
            [0019]由實施例1中的3項檢測結果可知:相對正常肝組織,NDC80基因在原發性肝癌(HBV-)中表達上調,在原發性肝癌(HBV+)上調更加明顯。
            [0020]實施例2
            本實施例用到H印G2.2.15細胞和shNDC80細胞共2種細胞,實驗組為轉染了 siRNA的H印G2.2.1.5細胞(簡稱shNDC80細胞),對照組為H印G2.2.1.5細胞。
            [0021]一、乙肝病毒DNA和cccDNA的檢測
            1、乙肝病毒DNA的檢測:分別收集培養96h的H印G2.2.15細胞和shNDC80細胞以及其培養上清液;利用商品化的DNA提取試劑盒分別提取2種細胞的DNA,用RT-PCR檢測2種HBV感染細胞的DNA。PCR檢測引物如下:
            HBV-DAN-F:5,-ATGGAGAACACAACATCAGG-3,,
            HBV-DNA-R:5’ -GAGGCATAGCAGCAGGATG-3’ ;
            GAPDH-F:5,-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3,,
            GAPDH-R-R: 5’ -GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。
            [0022]檢測結果見圖2中的A圖。
            [0023]2、乙肝病毒cccDNA的檢測
            Cl)用PBS沖洗兩種細胞,4°C條件下,將兩種細胞分別在裂解液(50mM Tris, 10MmNaCl,0.l%Tr1n X_100,5mM MgCl2, ρΗ8.0)中裂解 1min ;
            (2)在4°C下,離心2min,將細胞核從270g細胞質中分離;
            (3)附加型DNA按照商品化的試劑盒操作從細胞核中提取;
            (4)沒有鏈酶蛋白酶的條件下,細胞在裂解液中裂解,另加0.25ml 2.5M的KCl沉淀得到蛋白質-洗滌液復合物;
            (5)搖晃以混合溶菌產物,離心除去細胞DNA;
            (6)上清液中的病毒性cccDNA從等體積的苯酚中提取;
            (7)HBV cccDNA用一種新的方法進一步凈化。(該方法通過RT-PCR對HBV cccDNA進行定量) (8)凈化后的HBV cccDNA通過RT-PCR檢測,PCR引物為:
            HBV-cccDNA-F:5,-GTCTGTGCCTTCTCATCTGCC-3,,
            HBV-cccDNA-R:5,-ACAGCTTGGAGGCTTGAACAG-3,
            之后,按照RT-PCR試劑盒操作進行目標RNA的定量檢測。
            [0024]乙肝病毒的DNA和cccDNA的檢測結果見圖2中的A圖,由圖A結果分析可知,在H印G2.2.15 shNDC80細胞系中,干擾NDC80使RNA水平處于低表達。
            [0025]二、HBsAg、HBcAg的檢測:通過免疫組織化學染色實驗間接分析H印G2.2.1.5細胞和shNDC80細胞的HBsAg和HBcAg。具體步驟如下:
            1.在4°C下,用4%多聚甲醛將轉染細胞固定20min,在TritonX-100中通透;
            2.在37°C下,用含有10%山羊血清的PBS孵化細胞;
            3.在4°C下,用含有HBsAg(BM0064)或HBcAg(BM0060)的特定的鼠類單克隆抗體孵化細胞過夜;
            4.滴加二抗試劑(生物素化二抗工作液)Jppcs30min ;
            5.使用試劑盒顯色;
            6.與蘇木精進行對比染色,再依次序在酒精和二甲苯中脫水;
            7.以PBS代替一抗作為陰性對照。
            [0026]染色結果見圖2中的B圖。
            [0027]實施例3 一、細胞生長曲線
            1.將H印G2.2.15細胞和shNDC80細胞分別用0.25%的胰蛋白酶消化,制成單細胞懸液,轉染了 siRNA的H印G2.2.1.5細胞為實驗組,未轉染siRNA的H印G2.2.1.5為對照組;
            2.用Freshney計數板對存活細胞計數:細胞濃度調整至lxl05/ml,即Iml細胞中大約有IxlO5個細胞,置于12孔板中的3個孔內;
            3.分別于24h、48h和72h后對存活細胞進行計數,并用平均值繪制細胞生長曲線。
            [0028]結果見圖3中的A圖。
            [0029]二、細胞活性測定
            用MTS含量測定不同時間點的細胞活性:在96孔托盤中,通過MTS含量定量測定細胞活性。96孔托盤中,細胞密度為I X 130培養24小時后,加入測試藥物(測試藥物為MTT,全稱為3- (4,5_ 二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,商品名:噻唑藍),在37°C下,將培養液孵化不同的時間(0h,24h,48h,72h)。被治療的細胞以1:10的比例浸在MTS試劑中,在培養基中培養4h。每個孔的吸收值用酶標儀測定,吸收波長設定為490nm。每個樣品測定3次,做三次平行實驗,并繪制擴散曲線。
            [0030]測定結果見圖3中的B圖,從圖B中可以看出,在shNDC80細胞系中,肝癌細胞增殖的數量很少,活性很低。
            [0031]由實施例1-3的結果可知,NDC80是乙肝病毒感染導致肝癌發生的關鍵因子,該基因有助于進一步了解癌癥機制,為肝癌的防治提供新思路及策略。
            【主權項】
            1.一種乙肝病毒性肝癌基因NDC80,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
            2.權利要求1所述NDC80基因在作為預防或治療乙肝病毒性肝癌的基因靶點中的應用。
            3.一種防或治療乙肝病毒性肝癌的制劑,其特征在于,含有定量的抑制NDC80基因的抑制劑。
            【專利摘要】本發明涉及生物基因工程技術領域,具體公開了一種肝癌基因NDC80及其應用。本發明研究發現乙肝病毒感染肝細胞后,導致NDC80上調,上調后NDC80進一步使乙肝病毒繼續擴增,從而形成正反饋,最終,高表達的NDC80促使肝細胞增殖癌變,引起肝癌發生。所以,本發明首次確定NDC80是乙肝病毒感染導致肝癌發生的關鍵因子,該基因有助于進一步了解癌癥機制,為肝癌的防治提供新思路及策略。
            【IPC分類】C12N15-12, A61K45-00, A61P35-00
            【公開號】CN104673801
            【申請號】CN201510072049
            【發明人】劉波, 姚志成, 楊揚, 胡昆鵬, 黃河, 許石磊, 王慶亮
            【申請人】中山大學附屬第三醫院
            【公開日】2015年6月3日
            【申請日】2015年2月12日
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